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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】连接几次，仍然不见菌落出现
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zhangxn2010

木虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】连接几次，仍然不见菌落出现

最近做载体构建，很不顺。
主要是把酶切后的片段（约2000bp)连到载体上，转化后总是没有菌落出现。
前些天相同的位置连了另一条片段出现了很多克隆，测序也是对的，现在真是很迷茫（感态应该没问题，因为用的同一批；T4Ligase应该也没问题）

[ Last edited by zhangxn2010 on 2010-12-4 at 09:37 ]

PS:本帖中问题已在2011年解决，当时没有放上具体原因，现做说明，以对有相关问题的虫友有启发。
用相当长的时间排除，最后在电泳液上找出了问题，第一个载体构建完之前一直选用TAE做缓冲液，后来一个刚来的海归博士建议用TBE（理由当然是条带清楚之类的），噩梦就开始了，原来是TBE和胶回收试剂盒有冲突，造成回收产物不能进行连接。
希望虫子们多注意小细节，我因为这点失误耽误近两月，领导眼都快绿了（当然还有其他并行工作，否则直接被炒掉了）。

[ Last edited by zhangxn2010 on 2012-12-11 at 15:10 ]
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1楼 2010-12-04 08:25:19
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YaYa785

银虫 (小有名气)
★
zhangxn2010(金币+2): 2010-12-08 11:39:13
silicare(金币+1):谢谢参与 2010-12-08 12:22:18
这个原因其实很多，你说还连了另一个片段，是要再连一段形成2个片段的串联？两个末端的酶切位点一致么？和第二段另一个酶切位点buffer的兼容性呢？还有  这第二个片段酶切完全了没有？酶切问题很难确定不是说你把东西加进去就可以切开的，个人觉得是没有切开...切开了多少回连上一些的....再就是连接的问题...多做几个l连接比例试试...转化时感受态细胞浓度也不要太浓了...
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12楼2010-12-08 11:27:43
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YaYa785

银虫 (小有名气)
zhangxn2010(金币+1): 2011-03-14 13:03:46
引用回帖:
Originally posted by zhangxn2010 at 2010-12-08 12:18:53:

是这样的，我构建的载体可以放两个不同来源但是相同功能的基因，这两段基因我设计的酶切位点都一样，只是想看看不同来源基因表达量有什么不同，先把一段基因已经连上了，另外一段怎么也连不上，所以来求助。

嗯明白了...一步一步排除原因吧...
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14楼2010-12-08 12:24:02
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