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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】请教个关于inverse PCR的问题
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lhwei1987

铁杆木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】请教个关于inverse PCR的问题已有6人参与

用cDNA环化的方法做IPCR ，使用RNA Lagise 加25%PEG18h环化，环化后立即PCR总是可以出带，但是-20过夜再进行PCR的时候就一直得不到任何条带，不知道怎么回事，哪位可以给分析一下，谢谢！！
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1楼2010-11-19 19:35:21
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lhwei1987

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+2):感谢回帖交流 2010-11-21 10:09:25
lstt09nk(金币+3):在自己的帖子里帮助别人~ 2010-11-26 09:37:00
引用回帖:
Originally posted by adslye at 2010-11-20 23:50:30:

楼主，你好。
虽然我帮不上你，但是我想请求你帮助。
我做的是双链DNA i-PCR,但是我没有自身环化的资料。分子克隆也只是写了尽量低的浓度。
可否把你自环化的详细步骤和体系公布下。谢谢！！！

另外，个人 ...

我的过程相对简单，用cDNA，省了酶切的部分，如果是用DNA的话，我这有个资料，也是小木虫看到的：反向PCR （inverse-PCR）实验步骤
inverse-PCR是克隆插入片段侧翼序列非常有效的方法。通常采用的Tail-PCR假阳性太多，而Inverse-PCR一般只要有特异条带，基本上就是目的片段。
基本步骤如下：
1、反向PCR（Inverse PCR）原理：反向PCR是克隆T-DNA插入位点侧翼DNA序列非常有效的方法。
a. 选择合适的限制性内切酶位点。并在T-DNA的边界（左边界、右边界均可）和酶切位点附近设计引物P1、P2；
b. 回收DNA，T4连接酶连接，使酶切后的DNA片段环化；
c. 回收连接后的DNA，用引物P1、P2做PCR，就可扩增到两端为T-DNA插入序列，中间为侧翼序列的片段。
2、限制性内切酶消化：选择合适的限制性内切酶，基因组一定要切成弥散性的条带。在酶切之前，应对基因组DNA定量。
根据T-DNA的左边界序列选择合适的酶切位点EcoRI，BamHI和HindIII/PstI，并在酶切位点上游附近设计引物Z1，Z2，Z3和Z4，然后用这些内切酶分别消化基因组DNA，酶切体系如下：
Buffer for EcoR I         2μl
Genomic DNA         3μl
EcoR I         0.5μl （10u/μl）
ddH2O         14.5 μl
        20μl
37度 过夜，电泳检测酶切效果。
3、回收DNA
① 将酶切产物转到1.5ml离心管中，用ddH2O洗涤干净，并稀释到250μl；
② 加入等体积的酚和氯仿（V：V=1：1），涡旋混匀，室温静置1min；
③ 最大速度（13, 000 rpm）离心1min；
④ 将上清移到另一管中，加入等体积的氯仿，涡旋混匀，室温静置1min；
⑤ 最大速度（13, 000 rpm）离心2min；
⑥ 将上清移到另一管中，加入2.5倍体积的-20℃预冷的无水乙醇，0.1倍体积的3M 乙酸钠（pH=5.2），轻轻振荡混匀，室温静置5min；
⑦ 4℃最大速度（13, 000 rpm）离心10~15min；
⑧ 弃上清，尽量除去管壁上的液体；
⑨ 加入1ml -20℃预冷的70%乙醇，轻轻颠倒几次。最大速度（13, 000 rpm）离心5min；
⑩ 除去乙醇，在超净台上平放，将管壁上的乙醇挥发掉，20~40μl ddH2O溶解。-20℃保存。
4、连接。体系如下：
DNA        2μl
10×buffer        10μl
T4 ligase         1μl
ddH2O         87μl
        100μl
12-14℃   overnight
连接体系比较大，而DNA含量比较低，不需加入PEG4000，这样可以促进分子内的连接，减少分子间的连接。试验中我们采取蹇文婴等（2002）的方法（12-14℃连接48h）。连接完成后，65℃ 水浴10min灭活。按上述3.抽提回收，溶解于40μl ddH2O中。
然后就可以用回收的链接片段做PCR了。
本文来自: 小木虫论坛 http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=2109736
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7楼2010-11-21 09:26:25
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hwamg

银虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+1):鼓励交流 2010-11-21 10:09:03
lz 你想想反向PCR的原理吧。环话的DNA你放-20℃，有可能内部局部配对，形成自身的二级机构。接着做PCR的过程中即使变性（denaturing）不一定能解开这个复杂的二级结构

解决这个问题，你可以试着适当延长变性时间

[ Last edited by hwamg on 2010-11-20 at 16:15 ]
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3楼2010-11-20 16:13:02
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adslye

银虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by lhwei1987 at 2010-11-19 19:35:21:
用cDNA环化的方法做IPCR ，使用RNA Lagise 加25%PEG18h环化，环化后立即PCR总是可以出带，但是-20过夜再进行PCR的时候就一直得不到任何条带，不知道怎么回事，哪位可以给分析一下，谢谢！！

楼主，你好。
虽然我帮不上你，但是我想请求你帮助。
我做的是双链DNA i-PCR,但是我没有自身环化的资料。分子克隆也只是写了尽量低的浓度。
可否把你自环化的详细步骤和体系公布下。谢谢！！！

另外，个人认为你-20过夜后，DNA抱团了，40°水浴1小时，让它们温和的舒张开，也许好点。另外，环状DNA做模板PCR本来就困难，多重复也许能行。
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4楼2010-11-20 23:50:30
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wangy0908

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
顶一下。收获了。我也是在做的inverse pcr。但是怎么也扩不出来。正在郁闷中
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5楼2010-11-21 03:51:56
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