| 查看: 1099 | 回复: 2 | |||
shaojing690新虫 (初入文坛)
|
[交流]
【分享】反向PCR的步骤 已有2人参与
|
|
反向PCR （inverse-PCR）实验步骤 inverse-PCR是克隆插入片段侧翼序列非常有效的方法。通常采用的Tail-PCR假阳性太多，而Inverse-PCR一般只要有特异条带，基本上就是目的片段。 基本步骤如下： 1、反向PCR（Inverse PCR）原理：反向PCR是克隆T-DNA插入位点侧翼DNA序列非常有效的方法。 a. 选择合适的限制性内切酶位点。并在T-DNA的边界（左边界、右边界均可）和酶切位点附近设计引物P1、P2； b. 回收DNA，T4连接酶连接，使酶切后的DNA片段环化； c. 回收连接后的DNA，用引物P1、P2做PCR，就可扩增到两端为T-DNA插入序列，中间为侧翼序列的片段。 2、限制性内切酶消化：选择合适的限制性内切酶，基因组一定要切成弥散性的条带。在酶切之前，应对基因组DNA定量。 根据T-DNA的左边界序列选择合适的酶切位点EcoRI，BamHI和HindIII/PstI，并在酶切位点上游附近设计引物Z1，Z2，Z3和Z4，然后用这些内切酶分别消化基因组DNA，酶切体系如下： Buffer for EcoR I 2μl Genomic DNA 3μl EcoR I 0.5μl （10u/μl） ddH2O 14.5 μl 20μl 37度 过夜，电泳检测酶切效果。 3、回收DNA ① 将酶切产物转到1.5ml离心管中，用ddH2O洗涤干净，并稀释到250μl； ② 加入等体积的酚和氯仿（V：V=1：1），涡旋混匀，室温静置1min； ③ 最大速度（13, 000 rpm）离心1min； ④ 将上清移到另一管中，加入等体积的氯仿，涡旋混匀，室温静置1min； ⑤ 最大速度（13, 000 rpm）离心2min； ⑥ 将上清移到另一管中，加入2.5倍体积的-20℃预冷的无水乙醇，0.1倍体积的3M 乙酸钠（pH=5.2），轻轻振荡混匀，室温静置5min； ⑦ 4℃最大速度（13, 000 rpm）离心10~15min； ⑧ 弃上清，尽量除去管壁上的液体； ⑨ 加入1ml -20℃预冷的70%乙醇，轻轻颠倒几次。最大速度（13, 000 rpm）离心5min； ⑩ 除去乙醇，在超净台上平放，将管壁上的乙醇挥发掉，20~40μl ddH2O溶解。-20℃保存。 4、连接。体系如下： DNA 2μl 10×buffer 10μl T4 ligase 1μl ddH2O 87μl 100μl 12-14℃ overnight 连接体系比较大，而DNA含量比较低，不需加入PEG4000，这样可以促进分子内的连接，减少分子间的连接。试验中我们采取蹇文婴等（2002）的方法（12-14℃连接48h）。连接完成后，65℃ 水浴10min灭活。按上述3.抽提回收，溶解于40μl ddH2O中。 然后就可以用回收的链接片段做PCR了。 |
回复此楼» 猜你喜欢
材料专硕322
已经有7人回复
-
求调剂
已经有20人回复
-
一志愿郑州大学085600求调剂
已经有20人回复
-
化学调剂
已经有17人回复
-
3-溴吡啶-4-甲醛合成
已经有9人回复
-
一志愿南京航空航天大学 材料与化工329分求调剂
已经有3人回复
-
285求调剂
已经有9人回复
-
材料求调剂
已经有11人回复
-
调剂
已经有8人回复
-
材料调剂
已经有14人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 基因工程课程小结
已经有20人回复
- 反向PCR之单引物扩增，真悲剧
已经有15人回复
- 反向PCR求助！
已经有14人回复
- 【求助/交流】请教个关于inverse PCR的问题
已经有21人回复
- 【求助/交流】反向PCR的问题
已经有4人回复
- 【求助/交流】关于反向PCR 和测序结果的拼接
已经有10人回复
- 【求助/交流】反向PCR的问题
已经有11人回复
- 生物学软件介绍及其下载地址【学生物的会很有用】
已经有24人回复
| 谢谢分享！ |
2楼2010-06-02 17:09:00
范儿
铜虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 396.9
- 散金: 60
- 帖子: 120
- 在线: 65.3小时
- 虫号: 2032722
- 注册: 2012-09-27
- 性别: GG
- 专业: 系统生物学
3楼2012-11-14 21:18:21
10