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pidou213

木虫 (正式写手)


[交流] 【求助/交流】荧光定量 有DNA污染

咋办呢?

我怕经过DNA酶处理一下后,RNA恐怕就讲解完了
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lixg

铁杆木虫 (正式写手)



dhd997(金币+1):鼓励交流 2010-11-17 08:33:03
pidou213(金币+1):xianxiexie 2010-11-17 23:45:53
不会的,只要用RNase free 的DNase处理,不会降解RNA的。
2楼2010-11-17 08:32:26
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bigboy123

铜虫 (小有名气)



lstt09nk(金币+1):鼓励交流 2010-11-17 11:17:31
那个DNA要想完全去除是不现实的,关键是要找到为什么污染和污染源在哪里,这样才是办法。
3楼2010-11-17 09:45:58
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pidou213

木虫 (正式写手)


引用回帖:
Originally posted by lixg at 2010-11-17 08:32:26:
不会的,只要用RNase free 的DNase处理,不会降解RNA的。

可是操作起来会不会降解的很快呢
4楼2010-11-17 23:45:21
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pidou213

木虫 (正式写手)



silicare(金币+1):DNA污染是不可避免的,也是无法根除的,多多少少都会有残余的,多了只能消化 2010-11-18 08:12:00
引用回帖:
Originally posted by bigboy123 at 2010-11-17 09:45:58:
那个DNA要想完全去除是不现实的,关键是要找到为什么污染和污染源在哪里,这样才是办法。

你的意思是完全无法去除DNA吗?
5楼2010-11-17 23:45:42
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bigboy123

铜虫 (小有名气)


这个主要是荧光PCR敏感性太高了,有点就能检测出。要是PCR产物的污染还有办法,要是混在样本中则得废弃样本了,所以关键要搞清楚为什么出现污染和污染源在哪里。
6楼2010-11-18 09:40:52
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lixg

铁杆木虫 (正式写手)



lstt09nk(金币+1):鼓励交流 2010-11-19 10:50:10
pidou213(金币+1):谢谢啊 2010-11-20 00:52:54
哪有这么复杂啊。trizol法提取RNA后,通行的做法都是用RNase free 的DNase处理,去除基因组污染。然后进行反转录。如果还不放心,就在内含子上设计一对内参引物(跨外显子),用反转录产物做个PCR,35个循环,电泳检测,如无目的条带,就可以了。
7楼2010-11-19 10:44:34
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yidaqunyan

木虫 (正式写手)


pidou213(金币+2):谢谢啊,能否告知在哪里买比较好? 2010-11-20 00:52:45
买一个双提的试剂盒,效果比较好,直接DNA就被吸附了
8楼2010-11-19 11:16:05
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cyz20050505

木虫 (正式写手)


引用回帖:
Originally posted by pidou213 at 2010-11-17 00:06:03:
咋办呢?

我怕经过DNA酶处理一下后,RNA恐怕就讲解完了

你怎么判断是DNA污染,贴图出来看下嘛
9楼2010-11-19 16:04:14
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pidou213

木虫 (正式写手)


引用回帖:
Originally posted by lixg at 2010-11-19 10:44:34:
哪有这么复杂啊。trizol法提取RNA后,通行的做法都是用RNase free 的DNase处理,去除基因组污染。然后进行反转录。如果还不放心,就在内含子上设计一对内参引物(跨外显子),用反转录产物做个PCR,35个循环,电泳 ...

问题出现了非目的条带啊
10楼2010-11-20 00:51:58
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pidou213

木虫 (正式写手)


引用回帖:
Originally posted by yidaqunyan at 2010-11-19 11:16:05:
买一个双提的试剂盒,效果比较好,直接DNA就被吸附了

可是很贵啊
11楼2010-11-20 00:52:22
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yidaqunyan

木虫 (正式写手)


pidou213(金币+3):谢谢啊 物品的是昆虫的 2010-11-21 14:17:24
引用回帖:
Originally posted by yidaqunyan at 2010-11-19 11:16:05:
买一个双提的试剂盒,效果比较好,直接DNA就被吸附了

我是用的原平皓的试剂盒,双提的,效果还好,大概一千多一点,五十次,不知道你什么材料
12楼2010-11-20 14:46:23
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脱水拂空

铜虫 (正式写手)


试剂pH值没有调好,如果pH对于DNA和RNA就容易分开
13楼2010-11-21 00:45:38
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wangy0908

金虫 (正式写手)


提取的RNA必须经过去DNA的,特别是作RT-qPCR。一般;来说都不会出现什么问题的。
14楼2010-11-21 03:46:04
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pidou213

木虫 (正式写手)


引用回帖:
Originally posted by wangy0908 at 2010-11-21 03:46:04:
提取的RNA必须经过去DNA的,特别是作RT-qPCR。一般;来说都不会出现什么问题的。

我最怕的就是在后期处理中RNA又出现不同程度的降解!~~
15楼2010-11-21 14:17:55
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yidaqunyan

木虫 (正式写手)


pidou213(金币+1):谢谢你啊 2010-11-22 11:23:25
引用回帖:
Originally posted by yidaqunyan at 2010-11-20 14:46:23:


我是用的原平皓的试剂盒,双提的,效果还好,大概一千多一点,五十次,不知道你什么材料

如果你打算用原平皓的试剂盒,我可以帮你联系下
16楼2010-11-21 15:40:29
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apple6299

铁杆木虫 (正式写手)



dhd997(金币+1):鼓励交流 2010-11-22 08:28:48
比较关注这个问题。最近做QPCR,同批次的细胞样品,提RNA,DNA酶消化后反转,之后做定量PCR检测。但是估计是有DNA  基因组消化不完全,实验数据有时偏差蛮大的!不知道如何简单判断基因组消化是否完全
17楼2010-11-21 19:47:43
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wangy0908

金虫 (正式写手)



dhd997(金币+1):鼓励交流 2010-11-22 08:28:38
引用回帖:
Originally posted by pidou213 at 2010-11-21 14:17:55:



我最怕的就是在后期处理中RNA又出现不同程度的降解!~~

不会的,即使降解,所有的基因mRNA也都是同步降解的,也不会影响你的实验结果
18楼2010-11-22 01:24:43
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pidou213

木虫 (正式写手)


引用回帖:
Originally posted by wangy0908 at 2010-11-22 01:24:43:

不会的,即使降解,所有的基因mRNA也都是同步降解的,也不会影响你的实验结果

但愿如此吧,毕竟没有官方的文件啊,再说,最主要的是怕操作过程中的污染,到最后可能会导致得不偿失啊
19楼2010-11-22 11:24:08
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