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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】荧光定量 有DNA污染
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pidou213

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】荧光定量 有DNA污染

咋办呢？

我怕经过DNA酶处理一下后，RNA恐怕就讲解完了
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1楼 2010-11-17 00:06:03
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lixg

铁杆木虫 (正式写手)
★
dhd997(金币+1):鼓励交流 2010-11-17 08:33:03
pidou213(金币+1):xianxiexie 2010-11-17 23:45:53
不会的，只要用RNase free 的DNase处理，不会降解RNA的。
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2楼2010-11-17 08:32:26
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bigboy123

铜虫 (小有名气)
★
lstt09nk(金币+1):鼓励交流 2010-11-17 11:17:31
那个DNA要想完全去除是不现实的，关键是要找到为什么污染和污染源在哪里，这样才是办法。
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3楼2010-11-17 09:45:58
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pidou213

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by lixg at 2010-11-17 08:32:26:
不会的，只要用RNase free 的DNase处理，不会降解RNA的。

可是操作起来会不会降解的很快呢
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4楼2010-11-17 23:45:21
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pidou213

木虫 (正式写手)
★
silicare(金币+1):DNA污染是不可避免的，也是无法根除的，多多少少都会有残余的，多了只能消化 2010-11-18 08:12:00
引用回帖:
Originally posted by bigboy123 at 2010-11-17 09:45:58:
那个DNA要想完全去除是不现实的，关键是要找到为什么污染和污染源在哪里，这样才是办法。

你的意思是完全无法去除DNA吗？
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5楼2010-11-17 23:45:42
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bigboy123

铜虫 (小有名气)
这个主要是荧光PCR敏感性太高了，有点就能检测出。要是PCR产物的污染还有办法，要是混在样本中则得废弃样本了，所以关键要搞清楚为什么出现污染和污染源在哪里。
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6楼2010-11-18 09:40:52
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lixg

铁杆木虫 (正式写手)
★
lstt09nk(金币+1):鼓励交流 2010-11-19 10:50:10
pidou213(金币+1):谢谢啊 2010-11-20 00:52:54
哪有这么复杂啊。trizol法提取RNA后，通行的做法都是用RNase free 的DNase处理，去除基因组污染。然后进行反转录。如果还不放心，就在内含子上设计一对内参引物（跨外显子），用反转录产物做个PCR，35个循环，电泳检测，如无目的条带，就可以了。
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7楼2010-11-19 10:44:34
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yidaqunyan

木虫 (正式写手)
pidou213(金币+2):谢谢啊，能否告知在哪里买比较好？ 2010-11-20 00:52:45
买一个双提的试剂盒，效果比较好，直接DNA就被吸附了
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8楼2010-11-19 11:16:05
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cyz20050505

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by pidou213 at 2010-11-17 00:06:03:
咋办呢？

我怕经过DNA酶处理一下后，RNA恐怕就讲解完了

你怎么判断是DNA污染，贴图出来看下嘛
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9楼2010-11-19 16:04:14
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pidou213

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by lixg at 2010-11-19 10:44:34:
哪有这么复杂啊。trizol法提取RNA后，通行的做法都是用RNase free 的DNase处理，去除基因组污染。然后进行反转录。如果还不放心，就在内含子上设计一对内参引物（跨外显子），用反转录产物做个PCR，35个循环，电泳 ...

问题出现了非目的条带啊
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10楼2010-11-20 00:51:58
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pidou213

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by yidaqunyan at 2010-11-19 11:16:05:
买一个双提的试剂盒，效果比较好，直接DNA就被吸附了

可是很贵啊
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11楼2010-11-20 00:52:22
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yidaqunyan

木虫 (正式写手)
pidou213(金币+3):谢谢啊 物品的是昆虫的 2010-11-21 14:17:24
引用回帖:
Originally posted by yidaqunyan at 2010-11-19 11:16:05:
买一个双提的试剂盒，效果比较好，直接DNA就被吸附了

我是用的原平皓的试剂盒，双提的，效果还好，大概一千多一点，五十次，不知道你什么材料
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12楼2010-11-20 14:46:23
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脱水拂空

铜虫 (正式写手)
试剂pH值没有调好，如果pH对于DNA和RNA就容易分开
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13楼2010-11-21 00:45:38
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wangy0908

金虫 (正式写手)
提取的RNA必须经过去DNA的，特别是作RT-qPCR。一般；来说都不会出现什么问题的。
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14楼2010-11-21 03:46:04
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pidou213

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by wangy0908 at 2010-11-21 03:46:04:
提取的RNA必须经过去DNA的，特别是作RT-qPCR。一般；来说都不会出现什么问题的。

我最怕的就是在后期处理中RNA又出现不同程度的降解！~~
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15楼2010-11-21 14:17:55
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yidaqunyan

木虫 (正式写手)
pidou213(金币+1):谢谢你啊 2010-11-22 11:23:25
引用回帖:
Originally posted by yidaqunyan at 2010-11-20 14:46:23:


我是用的原平皓的试剂盒，双提的，效果还好，大概一千多一点，五十次，不知道你什么材料

如果你打算用原平皓的试剂盒，我可以帮你联系下
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16楼2010-11-21 15:40:29
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apple6299

铁杆木虫 (正式写手)
★
dhd997(金币+1):鼓励交流 2010-11-22 08:28:48
比较关注这个问题。最近做QPCR，同批次的细胞样品，提RNA，DNA酶消化后反转，之后做定量PCR检测。但是估计是有DNA  基因组消化不完全，实验数据有时偏差蛮大的！不知道如何简单判断基因组消化是否完全
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17楼2010-11-21 19:47:43
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wangy0908

金虫 (正式写手)
★
dhd997(金币+1):鼓励交流 2010-11-22 08:28:38
引用回帖:
Originally posted by pidou213 at 2010-11-21 14:17:55:



我最怕的就是在后期处理中RNA又出现不同程度的降解！~~

不会的，即使降解，所有的基因mRNA也都是同步降解的，也不会影响你的实验结果
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18楼2010-11-22 01:24:43
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pidou213

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by wangy0908 at 2010-11-22 01:24:43:

不会的，即使降解，所有的基因mRNA也都是同步降解的，也不会影响你的实验结果

但愿如此吧，毕竟没有官方的文件啊，再说，最主要的是怕操作过程中的污染，到最后可能会导致得不偿失啊
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19楼2010-11-22 11:24:08
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