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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于酶切问题
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beisimai895

木虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】关于酶切问题 已有10人参与

最近做了一个克隆，转化之后做菌落PCR，验证均连接成功，但是酶切的时候却观察不到目的条带，做的这个克隆，载体大小为7KB，目的片段为480bp，酶切后，可以看见载体，但看不到目的条带，现在有个问题想请教，是否是因为目的片段和载体相差太大，所用即使观察到了载体（条带也不是很亮），但是去看不到目的片段，或者还有别的原因？
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1楼 2010-10-26 13:12:05
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
你说的有可能，还有一个可能——没有切开！
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2楼2010-10-26 13:15:00
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
应该是相差太悬殊了，如果载体也不是很亮，那么小的片段肯定是看不到的。
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Thank-you，so-blue.
3楼2010-10-26 20:26:06
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898763077

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
该是相差太悬殊了，如果载体也不是很亮，那么小的片段肯定是看不到的。
本文来自: 小木虫论坛 " target="_blank">http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=2529197&fpage=1
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4楼2010-10-26 20:30:13
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glannee

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+2):鼓励交流！ 2010-10-26 22:33:02
我做过一个类似的，0.3kb大小的条带也可以看到。
如果酶切没问题的话，只是需要加大酶切体系，比如100μL，然后上样、回收……
不过还有一种可能，就是你的载体上存在类似的序列，导致你P出来的并非是连接上去的片段
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纯如百合，坚如铁。
5楼2010-10-26 21:59:08
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huainianshili

金虫 (正式写手)
加大胶浓度
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向光电总机及其全家及其全家的祖宗八代致以崇高的敬意
6楼2010-10-26 22:06:34
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tigertang

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
如果克隆是对的话，酶切体系也没问题，扫胶的时候增加曝光时间，应该可以看到目的带。
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7楼2010-10-26 23:40:30
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jackiechubut

木虫 (小有名气)
★ ★
reasonspare(金币+2):谢谢分享。 2010-10-27 07:06:18
载体构建时，PCR验证有很大的假阳性，所以那个结果不能说明问题。如果说你连接成功了，但是酶切的时候看不到，可能是差别太大（7KB与480bp亮度差别有14倍），所以需要足够的质粒进行酶切，或者用EB染色的时候跑胶太久的话EB反方向跑出去而小片段看不到，而且小片段DNA跑太久也会弥散的厉害 。所以可以加大酶切质粒的量，也可以电泳时间缩短 只要能看到就好了。否则也许可能连接没有成功
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一笑寂寥空万古，三分明月照大江
8楼2010-10-27 01:12:57
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csdyg

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
reasonspare(金币+2):谢谢分享。 2010-10-27 07:06:30
这个大部分应该是因为你的载体和插入片段相差太大了，我做了一个1000bp插入，3000载体的，酶切后都不清晰，加大上样量效果也不太好。

菌落PCR假阳性太多，不好判断。

你可以试一下提取质粒后PCR。

无论如何，不如载体上找通用引物，或者利用你插入片段上的特异引物送测序好一些。

[ Last edited by csdyg on 2010-10-27 at 03:32 ]
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9楼2010-10-27 03:30:40
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amilie030312

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
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silicare(金币+2):鼓励交流 2010-10-27 12:04:29
首先就是上面的好多虫虫说过的片段差距太大，小片段的量已经不足以看到了。
如果你做的是双切那也有可能是一个酶切开了另外一个酶没有切开，可以两个酶分开来切一下试试看，如果有一个酶切不开就说明是这个问题了。
另外你前面做连接之前是否也进行过酶切，如果进行过那也可能是那一步酶切的时候所用的酶有核酸外切酶活性，把片段的末端切掉了几个碱基，连接还是能正常进行但是连上之后的酶切位点就产生了变化，所以再进行酶切的时候位点不对了也就切不开了。
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10楼2010-10-27 09:43:26
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