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beisimai895

木虫 (小有名气)

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专业: 生物化学

[交流] 【求助/交流】关于酶切问题已有10人参与

最近做了一个克隆，转化之后做菌落PCR，验证均连接成功，但是酶切的时候却观察不到目的条带，做的这个克隆，载体大小为7KB，目的片段为480bp，酶切后，可以看见载体，但看不到目的条带，现在有个问题想请教，是否是因为目的片段和载体相差太大，所用即使观察到了载体（条带也不是很亮），但是去看不到目的片段，或者还有别的原因？

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1楼 2010-10-26 13:12:05

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amilie030312

金虫 (正式写手)

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专业: 动物遗传学

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
silicare(金币+2):鼓励交流 2010-10-27 12:04:29

首先就是上面的好多虫虫说过的片段差距太大，小片段的量已经不足以看到了。
如果你做的是双切那也有可能是一个酶切开了另外一个酶没有切开，可以两个酶分开来切一下试试看，如果有一个酶切不开就说明是这个问题了。
另外你前面做连接之前是否也进行过酶切，如果进行过那也可能是那一步酶切的时候所用的酶有核酸外切酶活性，把片段的末端切掉了几个碱基，连接还是能正常进行但是连上之后的酶切位点就产生了变化，所以再进行酶切的时候位点不对了也就切不开了。