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beisimai895

木虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】关于酶切问题 已有10人参与

最近做了一个克隆,转化之后做菌落PCR,验证均连接成功,但是酶切的时候却观察不到目的条带,做的这个克隆,载体大小为7KB,目的片段为480bp,酶切后,可以看见载体,但看不到目的条带,现在有个问题想请教,是否是因为目的片段和载体相差太大,所用即使观察到了载体(条带也不是很亮),但是去看不到目的片段,或者还有别的原因?
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csdyg

木虫 (正式写手)

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
reasonspare(金币+2):谢谢分享。 2010-10-27 07:06:30
这个大部分应该是因为你的载体和插入片段相差太大了,我做了一个1000bp插入,3000载体的,酶切后都不清晰,加大上样量效果也不太好。

菌落PCR假阳性太多,不好判断。

你可以试一下提取质粒后PCR。

无论如何,不如载体上找通用引物,或者利用你插入片段上的特异引物送测序好一些。

[ Last edited by csdyg on 2010-10-27 at 03:32 ]
9楼2010-10-27 03:30:40
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