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beisimai895

木虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】关于酶切问题 已有10人参与

最近做了一个克隆,转化之后做菌落PCR,验证均连接成功,但是酶切的时候却观察不到目的条带,做的这个克隆,载体大小为7KB,目的片段为480bp,酶切后,可以看见载体,但看不到目的条带,现在有个问题想请教,是否是因为目的片段和载体相差太大,所用即使观察到了载体(条带也不是很亮),但是去看不到目的片段,或者还有别的原因?
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jackiechubut

木虫 (小有名气)

★ ★
reasonspare(金币+2):谢谢分享。 2010-10-27 07:06:18
载体构建时,PCR验证有很大的假阳性,所以那个结果不能说明问题。如果说你连接成功了,但是酶切的时候看不到,可能是差别太大(7KB与480bp亮度差别有14倍),所以需要足够的质粒进行酶切,或者用EB染色的时候跑胶太久的话EB反方向跑出去而小片段看不到,而且小片段DNA跑太久也会弥散的厉害 。所以可以加大酶切质粒的量,也可以电泳时间缩短 只要能看到就好了。否则也许可能连接没有成功
一笑寂寥空万古,三分明月照大江
8楼2010-10-27 01:12:57
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
你说的有可能,还有一个可能——没有切开!
2楼2010-10-26 13:15:00
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
应该是相差太悬殊了,如果载体也不是很亮,那么小的片段肯定是看不到的。
Thank-you,so-blue.
3楼2010-10-26 20:26:06
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898763077

铜虫 (初入文坛)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
该是相差太悬殊了,如果载体也不是很亮,那么小的片段肯定是看不到的。
本文来自: 小木虫论坛 " target="_blank">http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=2529197&fpage=1
4楼2010-10-26 20:30:13
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