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beisimai895

木虫 (小有名气)

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[交流] 【求助/交流】关于酶切问题已有10人参与

最近做了一个克隆，转化之后做菌落PCR，验证均连接成功，但是酶切的时候却观察不到目的条带，做的这个克隆，载体大小为7KB，目的片段为480bp，酶切后，可以看见载体，但看不到目的条带，现在有个问题想请教，是否是因为目的片段和载体相差太大，所用即使观察到了载体（条带也不是很亮），但是去看不到目的片段，或者还有别的原因？

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1楼 2010-10-26 13:12:05

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jackiechubut

木虫 (小有名气)

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★ ★
reasonspare(金币+2):谢谢分享。 2010-10-27 07:06:18

载体构建时，PCR验证有很大的假阳性，所以那个结果不能说明问题。如果说你连接成功了，但是酶切的时候看不到，可能是差别太大（7KB与480bp亮度差别有14倍），所以需要足够的质粒进行酶切，或者用EB染色的时候跑胶太久的话EB反方向跑出去而小片段看不到，而且小片段DNA跑太久也会弥散的厉害。所以可以加大酶切质粒的量，也可以电泳时间缩短只要能看到就好了。否则也许可能连接没有成功