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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】离子交换纯化原核表达蛋白
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cgt713

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】离子交换纯化原核表达蛋白 已有6人参与

目的蛋白的等电点是6.0左右，目的蛋白无纯化标签，我选择GE的CM-Sepharose F.F.进行纯化，pH5.1醋酸缓冲液平衡柱子和上样，然后用pH5.1醋酸缓冲液（内含0-0.5mol/L的NaCl）进行梯度洗脱，通过测定蛋白浓度，跑SDS-PAGE发现我的蛋白回收率特别低，然后我一直不知道我的蛋白跑哪里去了，后来我过完柱子后取一点柱子里的填料来煮样跑SDS-PAGE，发现原来还有很多蛋白(包括目的蛋白和杂蛋白）挂在柱子上，没有下来。我就加大了NaCl的浓度来洗脱，蛋白还是有很多下不来，请大家帮我分析下原因和提供点解决途径 谢谢。
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1楼 2010-09-19 09:15:58
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jjnch

木虫 (小有名气)
★
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1949stone:可以细致一点 2010-09-19 10:43:01
改pH洗脱好了
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2楼2010-09-19 10:42:09
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cgt713

银虫 (小有名气)

改变pH初步尝试了下 感觉没什么效果

引用回帖:
Originally posted by jjnch at 2010-09-19 10:42:09:
改pH洗脱好了

改变pH初步尝试了下 感觉没什么效果
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3楼2010-09-19 10:43:19
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月月大可

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
把pH再稍微提高一些。

你的明显结合力太强了
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4楼2010-09-19 11:23:03
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cgt713

银虫 (小有名气)

谢谢

引用回帖:
Originally posted by 月月大可 at 2010-09-19 11:23:03:
把pH再稍微提高一些。

你的明显结合力太强了

我也很奇怪呢 怎么结合力会这么强
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5楼2010-09-19 14:22:07
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月月大可

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
或者换Buffer 使用可卡酸钠试试
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6楼2010-09-19 22:24:30
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
0.5M的氯化钠明显太低，我都用过2M的，不过不是你这个层析柱。还有别的层析柱没，有的话去试一下，要是这个问题纠结，等解决了时间都过去了。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
7楼2010-09-19 23:24:28
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cgt713

银虫 (小有名气)

谢谢

引用回帖:
Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2010-09-19 23:24:28:
0.5M的氯化钠明显太低，我都用过2M的，不过不是你这个层析柱。还有别的层析柱没，有的话去试一下，要是这个问题纠结，等解决了时间都过去了。

是啊 我加大到2mol/L洗过 还是有很多下不来的哦
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8楼2010-09-20 09:02:47
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cgt713

银虫 (小有名气)

谢谢

引用回帖:
Originally posted by 月月大可 at 2010-09-19 22:24:30:
或者换Buffer 使用可卡酸钠试试

这个有什么影响吗/?
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9楼2010-09-20 09:03:32
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月月大可

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
尝试吧
不确定能解决问题
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10楼2010-09-20 09:20:23
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