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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】请教连接转化方面的问题
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我是果果

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】请教连接转化方面的问题 已有4人参与

我的目标片段有1400bp,琼脂糖凝胶电泳时有两条带,相隔很近,据说可能是两个亚型,切胶切不开,只能做连接,但连了几次都没连上,用的是pMD19-T载体,每次都只长出三四个菌落,而且都不是我要的,求助于各位高手!谢谢啦~
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1楼 2010-09-15 15:16:50
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月月大可

木虫 (著名写手)
★ ★
scelab(金币+2):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-09-15 23:28:45
奇怪了，做TA克隆还能有不长的。

酶能不能加A？ 回收的时候是否充分晾干乙醇？

TA克隆随便一连长的满板子都是，建议楼主从头开始反思自己的操作，注意细节问题。
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2楼2010-09-15 15:46:38
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jasco

木虫 (正式写手)
用的是taq酶么？如果用的pfx扩的需要加A才能连上T载
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3楼2010-09-15 15:49:35
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lu_zl

银虫 (小有名气)
★ ★
scelab(金币+2):谢谢交流！:tiger06: 2010-09-15 23:28:51
我是果果(金币+2): 2010-09-16 09:37:20
我相信楼主不会粗心到用高保真酶去PCR的。问题很可能是你的扩增片段浓度太低了，加大对载体的比例再连接。

还有你的平板中抗生素，IPTG XGAL等等有没有失效的？
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4楼2010-09-15 15:59:46
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tj_fjl

新虫 (初入文坛)
我是果果(金币+2): 2010-09-16 09:37:41
连转必须要保证片段的浓度，片段好的话，连接效率就好，你是平端连接，酶切还是重组？
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5楼2010-09-16 09:23:45
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我是果果

新虫 (初入文坛)
额...可能是浓度不够吧,我那应该是平端连接吧
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6楼2010-09-16 09:35:40
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tj_fjl

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 我是果果 at 2010-09-16 09:35:40:
额...可能是浓度不够吧,我那应该是平端连接吧

点检测一下你的片段，还有载体尽量切开！
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7楼2010-09-16 13:33:03
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香菱儿

铁杆木虫 (著名写手)
★
silicare(金币+1):谢谢参与 2010-10-13 12:01:54
引用回帖:
Originally posted by 我是果果 at 2010-09-16 09:35:40:
额...可能是浓度不够吧,我那应该是平端连接吧

你用的是pMD19-T载体，怎么会是平端连接呢？
你的PCR产物若是平端的话，需要加A
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漫洒英雄泪，相离处士家。谢慈悲剃度在莲台下。没缘法转眼分离乍。赤条条来去无牵挂。那里讨烟蓑雨笠卷单行？一任俺芒鞋破钵随缘化！
8楼2010-09-16 14:14:01
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我是果果

新虫 (初入文坛)
恩,是的,我后来问了我以前的老师,他也说要加A,让用高保真的Taq酶,然后提高浓度
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9楼2010-09-16 15:47:04
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lulu1986

捐助贵宾 (小有名气)
我是果果(金币+1): 2010-10-10 16:54:49
加A是一定要的！另外，按说T载体的连接是很容易的，关键注意片段要多，载体要少！我的经验一般是载体：片段：Solution1=1:4:5，指的是体积比。
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Nothingisimpossible!
10楼2010-10-09 09:59:11
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