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我是果果

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】请教连接转化方面的问题 已有4人参与

我的目标片段有1400bp,琼脂糖凝胶电泳时有两条带,相隔很近,据说可能是两个亚型,切胶切不开,只能做连接,但连了几次都没连上,用的是pMD19-T载体,每次都只长出三四个菌落,而且都不是我要的,求助于各位高手!谢谢啦~
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tj_fjl

新虫 (初入文坛)

我是果果(金币+2): 2010-09-16 09:37:41
连转必须要保证片段的浓度,片段好的话,连接效率就好,你是平端连接,酶切还是重组?
5楼2010-09-16 09:23:45
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月月大可

木虫 (著名写手)

★ ★
scelab(金币+2):热心虫友,欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-09-15 23:28:45
奇怪了,做TA克隆还能有不长的。

酶能不能加A? 回收的时候是否充分晾干乙醇?

TA克隆随便一连长的满板子都是,建议楼主从头开始反思自己的操作,注意细节问题。
2楼2010-09-15 15:46:38
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jasco

木虫 (正式写手)

用的是taq酶么?如果用的pfx扩的需要加A才能连上T载
3楼2010-09-15 15:49:35
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lu_zl

银虫 (小有名气)

★ ★
scelab(金币+2):谢谢交流!:tiger06: 2010-09-15 23:28:51
我是果果(金币+2): 2010-09-16 09:37:20
我相信楼主不会粗心到用高保真酶去PCR的。问题很可能是你的扩增片段浓度太低了,加大对载体的比例再连接。

还有你的平板中抗生素,IPTG XGAL等等有没有失效的?
4楼2010-09-15 15:59:46
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