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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】请教连接转化方面的问题
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我是果果

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】请教连接转化方面的问题 已有4人参与

我的目标片段有1400bp,琼脂糖凝胶电泳时有两条带,相隔很近,据说可能是两个亚型,切胶切不开,只能做连接,但连了几次都没连上,用的是pMD19-T载体,每次都只长出三四个菌落,而且都不是我要的,求助于各位高手!谢谢啦~
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1楼 2010-09-15 15:16:50
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tj_fjl

新虫 (初入文坛)
我是果果(金币+2): 2010-09-16 09:37:41
连转必须要保证片段的浓度，片段好的话，连接效率就好，你是平端连接，酶切还是重组？
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5楼2010-09-16 09:23:45
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月月大可

木虫 (著名写手)
★ ★
scelab(金币+2):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-09-15 23:28:45
奇怪了，做TA克隆还能有不长的。

酶能不能加A？ 回收的时候是否充分晾干乙醇？

TA克隆随便一连长的满板子都是，建议楼主从头开始反思自己的操作，注意细节问题。
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2楼2010-09-15 15:46:38
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jasco

木虫 (正式写手)
用的是taq酶么？如果用的pfx扩的需要加A才能连上T载
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3楼2010-09-15 15:49:35
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lu_zl

银虫 (小有名气)
★ ★
scelab(金币+2):谢谢交流！:tiger06: 2010-09-15 23:28:51
我是果果(金币+2): 2010-09-16 09:37:20
我相信楼主不会粗心到用高保真酶去PCR的。问题很可能是你的扩增片段浓度太低了，加大对载体的比例再连接。

还有你的平板中抗生素，IPTG XGAL等等有没有失效的？
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4楼2010-09-15 15:59:46
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