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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】带GST标签的重组蛋白的纯化？
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niuniu2010

铜虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】带GST标签的重组蛋白的纯化？ 已有11人参与

将带GST标签的重组蛋白进行酶切，怎样分离GST标签，目的蛋白及所用的酶切酶？能否用分子筛、跑胶等方法分离且保持目的蛋白的活性？
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1楼 2010-09-10 16:27:36
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jasco

木虫 (正式写手)
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scelab(金币+1):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-09-11 00:44:29
酶切好再次过柱，gst标签被吸附，你的目的蛋白在流穿里面，
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2楼2010-09-10 16:56:10
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月月大可

木虫 (著名写手)
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lstt09nk(金币+1):积极的大可~~欢迎常来~ 2010-09-15 00:11:26
GST在溶液中一般都是二聚体形式。

一般来说我们酶切后更换至binding buffer中再次过GST柱，标签和酶（pre酶）都挂在柱子上，目的蛋白穿透。

离子交换柱能不能分开要看你蛋白的性质了
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6楼2010-09-14 23:17:07
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dianaofyezi

金虫 (正式写手)
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scelab(金币+2):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-09-11 00:44:36
你的目的蛋白由多大，如果差异很大可以过分子筛分离。如果差别很小，可以过亲和纯化柱分离。只要操作得当都能保持蛋白活性除非你的蛋白很容易变形就需要多加注意了。
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52187644
3楼2010-09-10 22:57:35
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sdqzsdqz
lstt09nk:交流贴请勿纯表~ 2010-09-11 20:29:04
4楼2010-09-11 10:55:12
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niuniu2010

铜虫 (初入文坛)
我的目的蛋白分子量有16.7KD左右，加上GST标签有42.7KD左右大小，酶切酶有37KD左右。
大小差异不大，分子筛是否不能用呀？离子交换柱能用吗？
实验室现有分子筛和离子交换柱的填料，老板不愿买亲和柱，让我想办法解决，很迷茫呀，哪位牛人能帮忙解决问题呀，不胜感激。谢谢！
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5楼2010-09-11 11:00:06
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zyflf

木虫 (正式写手)
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引用回帖:
Originally posted by 月月大可 at 2010-09-14 23:17:07:
GST在溶液中一般都是二聚体形式。

一般来说我们酶切后更换至再次过GST柱，标签和酶（pre酶）都挂在柱子上，目的蛋白穿透。

离子交换柱能不能分开要看你蛋白的性质了

酶切后不是直接上柱吗，为什么要转至binding buffer中？
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7楼2010-09-16 10:29:24
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月月大可

木虫 (著名写手)
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引用回帖:
Originally posted by zyflf at 2010-09-16 10:29:24:




酶切后不是直接上柱吗，为什么要转至binding buffer中？

直接洗脱的蛋白中还有还原性谷胱甘肽，没法挂在柱子上。必须除掉！
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8楼2010-09-16 11:56:37
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zyflf

木虫 (正式写手)
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引用回帖:
Originally posted by 月月大可 at 2010-09-16 11:56:37:


直接洗脱的蛋白中还有还原性谷胱甘肽，没法挂在柱子上。必须除掉！

我刚开始做蛋白，能不能推荐一些资料？谢谢
zhangyongfu85@gmail.com
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9楼2010-09-17 11:03:35
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hugang2004_2000

木虫 (正式写手)
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lstt09nk(金币+2):感谢分享~ 2010-09-17 17:07:54
用那种带滤膜的离心管不行吗？如果用酶切后混合物过GST标签柱，那酶切用的酶不是也还混在目的蛋白里吗？但是如果用离心管的话，大于20KDa 的都可以被挡在离心管里，而你的蛋白石16左右，就可以穿过离心管的滤膜。把离心管外的滤液收集再用冷冻干燥或者再用10KDa过滤范围的离心管再浓缩一次，计算一下浓度，就可以测活性了。
刚才看了实验室里的那个离心管，全名是：Amicon Ultra centrifugal filter devices. 密理博的产品。

[ Last edited by hugang2004_2000 on 2010-9-17 at 12:24 ]
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10楼2010-09-17 12:22:53
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