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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】Ni柱洗脱蛋白
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qzhaiyan

木虫 (著名写手)

小胖子

[交流] 【求助/交流】Ni柱洗脱蛋白

我的蛋白以前都是用10和20mM咪唑洗杂蛋白，然后用250mM咪唑洗脱目的蛋白，效果很好。最近不知道为什么我的蛋白在10和20mM咪唑下就洗脱下来了，很奇怪。哪位高手指点一下！
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1楼 2010-08-11 16:20:03
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liouwzh

木虫 (正式写手)
qzhaiyan(金币+1): 2010-08-12 08:19:19
是不是其他盐离子浓度变了，盐离子浓度的改变对洗脱也是有影响的。
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2楼2010-08-11 16:24:26
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jasco

木虫 (正式写手)
qzhaiyan(金币+1): 2010-08-12 08:19:29
也可能柱子结合力不够了，镍柱再生一下
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3楼2010-08-11 16:37:40
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月月大可

木虫 (著名写手)
★ ★
reasonspare(金币+2):谢谢分享。 2010-08-12 06:00:11
qzhaiyan(金币+1): 2010-08-12 08:19:09
可能是柱子使用的久了，结合力变弱了。

使用0.2M EDTA   0.5M NaCl  洗脱掉Ni，大量水清洗干净后再次挂Ni。

也可以在洗掉Ni之后使用6M盐酸胍充分清洗，效果更加。
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4楼2010-08-11 23:44:48
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雪山飞狐7233

铁杆木虫 (著名写手)

铁杆小虫
学习一下！
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梦在路就在！
5楼2010-08-12 09:12:17
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xuguanghai

木虫 (职业作家)
qzhaiyan(金币+1): 2010-08-27 09:04:33
一个可能是你的蛋白出问题了，还有一个就是检查你的BUFFER的pH对不对，最后看看你的NI-柱是不是使用多次，微球变型造成微球破损之类的
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6楼2010-08-12 09:18:54
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sqhnsd

金虫 (正式写手)
qzhaiyan(金币+1): 2010-08-12 11:01:33
有些蛋白确实会存在这样的情况，在低浓度的咪唑下就会被洗脱下来，跟柱料还有你的蛋白都有关系。你可以这样做，用不含咪唑的binding buffer一直冲洗，知道非特异性结合的蛋白都被清洗干净，然后10 mM接0.5ml,20 mM接1ml，50 mM接1ml,直接250mM接上3-5管，然后都去跑SDS-PAGE去检测那一管比较纯。在低浓度咪唑条件下，杂蛋白还有你的目的蛋白都会被洗脱下来，因此，洗脱的体积要少，不能太多，否则你的蛋白都损失了，这部的目的为了去除杂蛋白。高浓度下收集你的样品，都搜集，然后看看那一管比较纯。
另外提醒：你这个蛋白是不是沉淀里面表达？如果是，你在洗脱的时候是不是没有加urea or sarkosyl?如果没有加，目的蛋白重新沉淀，直接从柱子上掉下来。
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7楼2010-08-12 09:29:28
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