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qzhaiyan实习版主
小胖子
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[交流]
【求助/交流】Ni柱洗脱蛋白
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| 我的蛋白以前都是用10和20mM咪唑洗杂蛋白，然后用250mM咪唑洗脱目的蛋白，效果很好。最近不知道为什么我的蛋白在10和20mM咪唑下就洗脱下来了，很奇怪。哪位高手指点一下！ |
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5楼2010-08-12 09:12:17
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6楼2010-08-12 09:18:54
qzhaiyan(金币+1): 2010-08-12 11:01:33
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有些蛋白确实会存在这样的情况，在低浓度的咪唑下就会被洗脱下来，跟柱料还有你的蛋白都有关系。你可以这样做，用不含咪唑的binding buffer一直冲洗，知道非特异性结合的蛋白都被清洗干净，然后10 mM接0.5ml,20 mM接1ml，50 mM接1ml,直接250mM接上3-5管，然后都去跑SDS-PAGE去检测那一管比较纯。在低浓度咪唑条件下，杂蛋白还有你的目的蛋白都会被洗脱下来，因此，洗脱的体积要少，不能太多，否则你的蛋白都损失了，这部的目的为了去除杂蛋白。高浓度下收集你的样品，都搜集，然后看看那一管比较纯。 另外提醒：你这个蛋白是不是沉淀里面表达？如果是，你在洗脱的时候是不是没有加urea or sarkosyl?如果没有加，目的蛋白重新沉淀，直接从柱子上掉下来。 |
7楼2010-08-12 09:29:28
