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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】帮我看一下质粒单双酶切图！
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ltakashi

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】帮我看一下质粒单双酶切图！ 已有18人参与

我的目的片段大小1800左右
连的是PMD-18T
第一张图是质粒提取图：


第二张图是单酶切图，用的是ECOR I

下面一张图是双酶切，用的是ECORI 和HIND III


帮我分析下，我的目的片段到底有没有可能连上去啊？
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1楼 2010-07-26 18:22:57
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ltakashi

银虫 (小有名气)
amisking:严禁纯表情发帖！ 2010-07-26 20:49:22
2楼2010-07-26 19:02:39
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黄大牛
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking:严禁纯表情发帖！ 2010-07-26 20:49:24
3楼2010-07-26 19:08:05
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ltakashi

银虫 (小有名气)
★
amisking(金币-1):严禁纯表情发帖！ 2010-07-26 20:49:29
4楼2010-07-26 19:22:15
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花花贝

金虫 (知名作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
双酶切 不是应该切出你的片段吗？切出来 跟marker比照一下
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5楼2010-07-26 20:07:58
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chemifunan

木虫 (正式写手)

海王小木虫
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+2):感谢交流~~ 2010-08-02 17:05:42
楼主同学 首先要说一下 跑质粒不用上marker 酶切以后跑的时候再上 质粒和Marker不能比大小 上了浪费了
你跑的胶条带倒是蛮好的

pMD18是T载体吧 你是TaqPCR直接连的？ 那告诉我你的片段和PCR引物上各有什么酶切位点 为何用EcoR和Hind切？

pMD18大概2k吧 你的片段1.8 即使你引物上带E/H 切出来也不太好比 可以再找个能区分的酶切位点切两个对照着看看

单酶切两条带 双酶切却是一条带 怎么回事？
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Bemühen Sie !
6楼2010-07-26 21:05:04
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ltakashi

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by chemifunan at 2010-07-26 21:05:04:
楼主同学 首先要说一下 跑质粒不用上marker 酶切以后跑的时候再上 质粒和Marker不能比大小 上了浪费了
你跑的胶条带倒是蛮好的

pMD18是T载体吧 你是TaqPCR直接连的？ 那告诉我你的片段和PCR引物上各有什么酶切 ...

PMD-18是T载体，大小在2600左右，我的目的片段是PCR之后回收得到的，PCR中用的TAQ酶可以自动加上A的！
我的目的基因里面没有ECOR I 和HIND III位点，所以我用这两个酶！
另外，我没有在引物上设计酶切位点！！

至于你最后一个问题，我也不清楚！
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7楼2010-07-26 21:21:54
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sunyongle1

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
做PCR试一试？
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8楼2010-07-26 21:32:48
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hubuzdw

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+2):感谢交流，看来你很喜欢用小老虎的表情~ 2010-08-02 17:06:42

图很奇怪，EcoR-I 有星活性，用HindIII好切，明显你的EcoR-I 酶切不完全，没的比，另外你DNA模板回收干净了？为什么不每次上个PMD18T和模板质粒的对照，相同条件处理的？

单纯的大小比较似乎有重组子，但有矛盾，双切只有一条带?用的什么Marker？溴酚蓝跑出胶孔有多远？
另外PCR鉴定不一定准确，要找多个证据，最好是测序，特别是自己怀疑的不能随便放弃，发现就在日常中。
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清风吟月,秋水伊人
9楼2010-07-26 22:16:54
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ltakashi

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by hubuzdw at 2010-07-26 22:16:54:

图很奇怪，EcoR-I 有星活性，用HindIII好切，明显你的EcoR-I 酶切不完全，没的比，另外你DNA模板回收干净了？为什么不每次上个PMD18T和模板质粒的对照，相同条件处理的？

单纯的大小比较似 ...

DNA回收后，做了验证，片段很单一无拖尾！
MARKER我用的DS 5000，
溴酚兰跑了大概有离胶底部1.5到2厘米之间。

另外你说的对照是怎么回事？
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10楼2010-07-27 10:42:55
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