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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】帮我看一下质粒单双酶切图！
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chemifunan

木虫 (正式写手)

海王小木虫
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
看天(金币+2):热心 2010-08-26 21:32:52
我知道pMD18是T载体 引物和片断内部都没有 载体上有 切完了还是一条带那就是没切开或者没连上

最后我是问你图是不是放反了 你怎么单酶切比双酶切多一条带 第二张图倒像是切的对的

TAE快检一下就行 找一个没切过的2.6k的质粒做对照 看有没有在此之上的 不要再上Marker了
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11楼2010-07-27 10:49:12
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ltakashi

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by chemifunan at 2010-07-27 10:49:12:
我知道pMD18是T载体 引物和片断内部都没有 载体上有 切完了还是一条带那就是没切开或者没连上

最后我是问你图是不是放反了 你怎么单酶切比双酶切多一条带 第二张图倒像是切的对的

TAE快检一下就行 找一个没 ...

没有贴反
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12楼2010-07-27 10:51:30
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chemifunan

木虫 (正式写手)

海王小木虫
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
现在好像是你在解答我的问题
你自己再分析一下吧
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Bemühen Sie !
13楼2010-07-27 11:01:21
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刘小乐

铜虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
不好说，还是比对着自己marker看基因片段大小是不是和目的基因一样
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互动互利互相学习
14楼2010-07-27 11:20:12
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hubuzdw

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
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lstt09nk(金币+3):很有耐心~~赞~~ 2010-08-02 17:07:11
看天(金币+1):热心 2010-08-26 21:33:12
引用回帖:
Originally posted by ltakashi at 2010-07-27 10:42:55:



DNA回收后，做了验证，片段很单一无拖尾！
MARKER我用的DS 5000，
溴酚兰跑了大概有离胶底部1.5到2厘米之间。

另外你说的对照是怎么回事？

你的DNA模板是质粒还是基因组DNA?如果是基因组DNA的话，把PCR产物用特异性酶切一下，看看PCR产物是否是目标条带。如果是质粒来源的话，就把PCR产物单独转一个（就是不加T载体的）做对照，看能不能转化出菌落来，如果能转化出来，说明有模板质粒污染。也可以单独转个T载体（不加片段，用水调体积），看看载体的自连，白菌和蓝菌的比例。
接着对你的图进行一下分析，
你的ECORI 单切可能是不完全酶切，所以你上个未酶切的质粒做对照，看看下面的较小的带是不是未酶切质粒的带。可以把质粒稀释之后再切，增加酶切时间，做到完全酶切，再分析。从你ECORI酶切的结果来看，有6个潜在的重组质粒（大带在MARKER的第一条带和第二条带之间），也有矛盾，是完全酶切的话，你的质粒大小已经大于6k。
建议你用HINDIII做个单切，要完全酶切，看看有没有在DNA MARKER 的第一条带和第二条带（5000-3000）之间的条带出现，如果有，可能是重组子。
你的双酶切，看第二个样可能是重组子，有很淡的1.8KB的带（第3条带附近），也有矛盾，应该在2.6KB上面有条4.4KB左右的带，而且1.8KB的带应该和2.6KB一样亮。
可以把怀疑是重组子的PCR鉴定一下，如果是大肠杆菌内部基因或者同源基因也要注意，或者模板质粒，PCR一样不能确定是不是重组子。最后可以测序鉴定。
如果没有模板质粒污染，而且片段没有HINDIII,ECORI位点（或者PCR扩增产生的突变），那么你的双酶切只能说明全是载体自连。大小不一是自环化产生的。
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清风吟月,秋水伊人
15楼2010-07-27 12:08:39
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naturedemon

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
可以吧酶切前，单酶切，双酶切放在同一张图，这样才好比较，可以先挑两个做做
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16楼2010-07-27 14:13:59
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zhouhuaxi

铜虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
测序是金标准 ，PCR可以试一下，假阳性高。但是从电泳图来看我觉得连上可能不大，我以前做也遇到过类似情况，就是酶切图看不懂。建议从头扩增，目的片段纯化后再连，T载体还是比较好连得。
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17楼2010-07-27 15:50:33
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randomqd

木虫 (小有名气)

樱花骑士

双酶切一条带，单酶切两条带。。。

也正常：
单酶切1000，500
双酶切500，500，500。。。看起来也是一条带
建议分析酶切位点。你想要什么结果？
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未来天空才是极限
18楼2010-07-28 10:46:15
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主
★ ★
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lstt09nk(金币+1):鼓励交流~~ 2010-08-02 17:07:26
觉得你可以先用序列上或者质粒上的引物做PCR鉴定一下，然后再把有目的条带的质粒进行酶切。。。
我也很诧异你的酶切结果 为什么双酶切那样  电泳时间适当延长些吧  但是2800跟1800应该挺好跑开的。。。
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
19楼2010-07-28 11:44:07
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nnsulei

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我也遇到了 类似的问题 用XBA 1 和 BAMH 1 怎么都切不出来  急的很啊 ～～
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努力做就有结果～
20楼2010-08-02 15:55:15
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