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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】帮我看一下质粒单双酶切图！
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chemifunan

木虫 (正式写手)

海王小木虫
★
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XbaI 有的时候有甲基化修饰 是总会切不开 可以用两个方法 一个是在旁边换一个酶切位点或者再就是把原来的质粒转化到S17-1等这样的去甲基化大肠里，再提出来后再切。
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Bemühen Sie !
21楼2010-08-14 07:26:50
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gaowei706

铁杆木虫 (职业作家)

资深潜水者
★
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你的片段是多大？片段中间有没有你用的酶的切点？
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逐渐失去棱角
22楼2010-08-14 07:33:51
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足下客

木虫 (正式写手)
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看天(金币+2):鼓励 2010-08-26 21:31:34
这个结果不对啊。请问楼主你第一张图提的质粒是同一种吗？我看着大小差别蛮大的，你是不是同时构建了好几个质粒呢？再就是不可能单酶切出来两条带，双酶切反而是一条带的。还有你做PCR验证了没有？如果PCR验证结果正确的话，最好是测一下序
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23楼2010-08-14 08:46:03
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linxi8579

铜虫 (正式写手)
★
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引用回帖:
Originally posted by hubuzdw at 2010-07-26 22:16:54:

图很奇怪，EcoR-I 有星活性，用HindIII好切，明显你的EcoR-I 酶切不完全，没的比，另外你DNA模板回收干净了？为什么不每次上个PMD18T和模板质粒的对照，相同条件处理的？

单纯的大小比较似 ...

请问你说的星活性是什么意思啊，所以切出了两条带吗？
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24楼2010-08-14 11:32:16
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linxi8579

铜虫 (正式写手)
★
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Originally posted by hubuzdw at 2010-07-27 12:08:39:

你的DNA模板是质粒还是基因组DNA?如果是基因组DNA的话，把PCR产物用特异性酶切一下，看看PCR产物是否是目标条带。如果是质粒来源的话，就把PCR产物单独转一个（就是不加T载体的）做对照，看能不能转化出菌落来， ...

弱问一下，重组子具体是个什么概念啊？谢谢哈。
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25楼2010-08-14 15:24:51
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hubuzdw

金虫 (正式写手)
★
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引用回帖:
Originally posted by linxi8579 at 2010-08-14 15:24:51:

弱问一下，重组子具体是个什么概念啊？谢谢哈。

重组子就是含有目标片断的质粒。
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清风吟月,秋水伊人
26楼2010-08-14 20:08:36
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hubuzdw

金虫 (正式写手)
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看天(金币+1):鼓励 2010-08-26 21:32:03
引用回帖:
Originally posted by linxi8579 at 2010-08-14 11:32:16:

请问你说的星活性是什么意思啊，所以切出了两条带吗？

星活性就是非特异性切割，主要是有些酶在高离子强度高甘油浓度或高酶量产生的。
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清风吟月,秋水伊人
27楼2010-08-14 20:11:55
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小虫子666

铁杆木虫 (正式写手)
★
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质粒电泳很亮，怎么酶切带很模糊呢？质粒你多少跑的电泳？酶切体系多大的？做个大体系看看会不会有你的目的条带？带上对照要不没有可比性。
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28楼2010-08-15 18:17:57
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怎么都行

银虫 (小有名气)
★ ★ ★
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看天(金币+2):鼓励交流 2010-08-26 21:32:41
EcoRI这种内切酶的Buffer比较特别，NEB的EcoRI和HindIII是不能同时双酶切的，Takara这两种酶双酶切需要1.5×M buffer，但酶切效率不高，应该延长酶切时间。
    不知道楼主用的Marker是什么，目的片段如果是1800bp的话，那切出来的产物比这个数目多57bp（依据pMD18-T载体图谱），电泳时应该还是在1800bp左右的位置，通过电泳图对比Marker能够分辩出来的。
    楼主用的电泳仪连接稳压器了么？从图上看似乎有电压不稳的迹象：同样的产物带在不同点样孔里迁移率有高有低。
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29楼2010-08-15 19:35:53
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海阔天空8158

木虫 (著名写手)
★
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首先，要说明一下用的电泳marker是哪种，便于判断条带大小。
另外，为什么不在同一张电泳图上将marker，单酶切，双酶切、空质粒（包括未酶切、单酶切、双酶切）跑一下呢？？这样楼主就清楚了。

祝实验顺利。
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天行健，君子以自强不息；地势坤，君子以厚德载物。
30楼2012-01-15 14:43:03
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