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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】求助!大家帮我看一下我的PCR体系有什么问题没?
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wwsw38

铁虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】求助!大家帮我看一下我的PCR体系有什么问题没? 已有16人参与

我最近在做一种未知菌的16SRDNA的PCR,一直没做出来,大家帮我看一下到底是哪里出现了问题?
        
              PCR体系:
               模板  5uL
               上游引物(2.5uM)  5uL        Tm 57.8
               下游引物(2.5uM)  5uL        Tm61.9              
               Mgcl2(50mM)       3 uL     
               10*PCR  buffer     5uL  
                dNTP (2.5mM )    1uL
               Taq酶(2u/ul)        1uL
               ddH2O                 25uL      

           反应程序:
                        95(5m)
                       
                        95(1m)
                        53(1m)
                        73(2m)

                        72(10m)

                   30个循环.
结果P不出来,并且我也不知道P出来的条带应该是多少bp?大家帮我分析分析吧,只有10个金币全送上.

他们给我的引物合成书上的TM值是:
               上游引物      Tm 57.8
               下游引物     Tm61.9

但是我根据TM=4(G+C)+2(A+T)引物长都为20BP,算出来的
               上游引物      Tm 60
               下游引物     Tm64
所以我的程序退火温度应该是多少呢?53会不会太低了?

[ Last edited by wwsw38 on 2010-4-23 at 21:56 ]
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为自己加油
1楼 2010-04-23 13:43:06
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wwsw38

铁虫 (小有名气)
怎么没人帮我看看啊,我在在线等啊
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为自己加油
2楼2010-04-23 15:00:20
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bihaiqingt

金虫 (小有名气)
wwsw38(金币+1):我试试看 2010-04-23 21:36
退火温度为什么用53？太低了吧？调到60度试试吧
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3楼2010-04-23 15:54:08
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bihaiqingt

金虫 (小有名气)
30循环应该只是第二阶段
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4楼2010-04-23 15:56:14
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hyde0706

木虫 (正式写手)
你的模板质量如何？引物设计有没有问题？这两个才是PCR最关键的因素。可以尝试将循环数增加一些。
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5楼2010-04-23 15:58:09
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dfl204

铁杆木虫 (著名写手)
体系中模板量一般不用体积来衡量。10-100ng质粒就够了，如果是gDNA可以多一些。

扩增不出来，首先要考虑模板是否降解，这个可以用其它引物来验证;
试着把MgCl2降一些，设计几个浓度梯度。
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6楼2010-04-23 16:00:36
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liyong1981

金虫 (正式写手)
同意楼上的，引物和模板最关键，引物设计的好，温度跨度很大也能P出来
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7楼2010-04-23 16:01:12
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
wwsw38(金币+1):我觉得可能最有可能的是提的DNA不质量不好,谢谢你 2010-04-23 19:15
引物也有点少，5-8ul就应该够了
dNTP肯定少了，4ul
Mg离子，3-4ul

总的来说你这个体系就dNTP有问题，看一下酶的说明书
扩不出来有可能是引物的问题，不过你至少应该做个温度梯度

你不知道产物多大，太奇怪了，谁给你的引物，怎么设计的
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8楼2010-04-23 16:02:36
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wwsw38

铁虫 (小有名气)
哦,我这个引物我刚查了一下扩出来应该是1500BP,引物应该没问题.我就是想看看体系和反应程序有没有什么问题
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为自己加油
9楼2010-04-23 16:17:45
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
哪家公司的酶？
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10楼2010-04-23 16:32:13
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