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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】求助!大家帮我看一下我的PCR体系有什么问题没?
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wwsw38

铁虫 (小有名气)
★ ★ ★
scelab(金币+3):鼓励新虫！欢迎多来交流！:tiger06: 2010-04-23 22:39
酶没问题,朋友用我的酶把他的P出来了...
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为自己加油
11楼2010-04-23 19:14:00
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wwling

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★
scelab(金币+3):鼓励新虫！欢迎多来交流！:tiger06: 2010-04-23 22:40
dNTP 少了吧 一般10uM 的20um 体系就加1 ul
也许 Taq 酶多了点
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12楼2010-04-23 21:27:02
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shuwenying

铁虫 (小有名气)
★ ★ ★
scelab(金币+3):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-04-24 00:35
wwsw38(金币+1): 2010-04-24 19:43
1500bp太长了吧！一般来说，我自己做实验的话，1000bp一下的用普通的Taq酶就能做出来了，要是超过1000bp，我就会用一些公司专门用于长片段PCR的Taq酶了，这方面你可以咨询一下有关公司
不知道你朋友用你的Taq做出来的片段是多长？也是1500bp左后这么长吗？
以上意见仅供参考~~
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13楼2010-04-23 22:47:48
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zjzz

木虫 (正式写手)

在通往变态的坦途上
wwsw38(金币+1): 2010-04-24 19:43
你的模板质量好吗？
如果肯定引物设计没大问题的话，
建议体系中加1%DMSO，再把温度降低2°
温度不要怕低，有杂带了咱还可以升温再扩嘛，至少有东西了一切就好说了
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终于熬成木虫了……
14楼2010-04-24 06:47:23
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wangqk198738

金虫 (正式写手)

问题是你得实验啊？

wwsw38(金币+1): 2010-04-24 19:44
要是实验没问题那就没问题，条带很亮，楼主说怎么可能有问题呢 ？要是没调到我感觉也正常，dNTP是不是有点少了？引物似乎多了很多。我以前用过的反应体系这样。但仅供参考，千万啊！这个东西要自己摸索的。无论是体系，还是以后的反应。
反应体系如下：
  Mg2+                      3µl
   模板（cDNA）       1µl
   Buffer                     5µl
   Primer-1                  1µl
   Primer-2                  1µl
   dNTPs                     4µl
   Taq酶              0.5µl
   ddH2O                    34µl
   Final volume             50ul   



扩增参数：94℃预变性5 min；94℃变性50 s、42℃退火30 s、72℃延伸1min，扩增30个循环；最后72℃延伸10 min
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15楼2010-04-24 07:59:42
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wlihust

铜虫 (小有名气)
你是做菌液PCR吗？如果是的话，那要先高温99摄氏度裂解菌体，然后作为模板PCR
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16楼2010-04-24 09:53:14
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wwsw38

铁虫 (小有名气)
谢谢大家,可能是
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为自己加油
17楼2010-04-24 19:44:21
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wwsw38

铁虫 (小有名气)
谢谢大家,可能是
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为自己加油
18楼2010-04-24 19:44:41
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wz-louis

银虫 (小有名气)
wwsw38(金币+2):谢谢,我今天58度扩了一次,还是有杂带,明天再60扩一次看看 2010-04-25 22:16
我觉得有可能出现以下几种可能：
1.提取的DNA质量有问题，后者说模板浓度太低。
2.退火温度，根据你所给的数据，建议你用59或者60度P一次。
3.我觉得你的dNTP的量有点少，可以适当调整以下你的体系。
其实，做实验有时P不出来时很正常的，加油吧！
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笑面人生
19楼2010-04-24 22:07:49
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dengqunliu

木虫 (知名作家)
建议做个梯度试一下，另外模板量可以减少点，太高了有时也出不来
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享受一下轻松
20楼2010-04-24 23:00:04
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