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wwsw38

铁虫 (小有名气)

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虫号: 943642
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专业: 微生物生理与生物化学

[交流] 【求助/交流】求助!大家帮我看一下我的PCR体系有什么问题没? 已有16人参与

我最近在做一种未知菌的16SRDNA的PCR,一直没做出来,大家帮我看一下到底是哪里出现了问题?

            PCR体系:
            模板  5uL
            上游引物(2.5uM)  5uL       Tm 57.8
            下游引物(2.5uM)  5uL       Tm61.9
            Mgcl2(50mM)    3 uL
            10*PCR  buffer    5uL
            dNTP (2.5mM ) 1uL
            Taq酶(2u/ul)       1uL
            ddH2O                25uL

         反应程序:
                     95(5m)

                     95(1m)
                     53(1m)
                     73(2m)

                     72(10m)

               30个循环.
结果P不出来,并且我也不知道P出来的条带应该是多少bp?大家帮我分析分析吧,只有10个金币全送上.

他们给我的引物合成书上的TM值是:
            上游引物    Tm 57.8
            下游引物    Tm61.9

但是我根据TM=4(G+C)+2(A+T)引物长都为20BP,算出来的
            上游引物    Tm 60
            下游引物    Tm64
所以我的程序退火温度应该是多少呢?53会不会太低了?

[ Last edited by wwsw38 on 2010-4-23 at 21:56 ]

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为自己加油

1楼 2010-04-23 13:43:06

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wangqk198738

金虫 (正式写手)

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专业: 生物化学与分子生物学

问题是你得实验啊？

wwsw38(金币+1): 2010-04-24 19:44

要是实验没问题那就没问题，条带很亮，楼主说怎么可能有问题呢？要是没调到我感觉也正常，dNTP是不是有点少了？引物似乎多了很多。我以前用过的反应体系这样。但仅供参考，千万啊！这个东西要自己摸索的。无论是体系，还是以后的反应。
反应体系如下：
  Mg2+                   3µl
模板（cDNA）    1µl
Buffer                   5µl
Primer-1                1µl
Primer-2                1µl
dNTPs                   4µl
Taq酶             0.5µl
ddH2O                   34µl
Final volume          50ul

扩增参数：94℃预变性5 min；94℃变性50 s、42℃退火30 s、72℃延伸1min，扩增30个循环；最后72℃延伸10 min