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Apfel

新虫 (小有名气)

[交流] 蛋白诱导 已有2人参与

我的目的基因的大小事1200多，克隆载体测序，表达载体测序都没有问题，可是用IPTG诱导的时候就是没有目的条带出来，我的载体是PET-21，诱导的条件是：37°C，IPTG浓度是1mM，做了好多次了，就是没有目的条带的出现。很着急，希望大家能给分析一下，感激涕零，不胜切切。

[ Last edited by Apfel on 2009-8-26 at 21:36 ]
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1楼 2009-08-26 21:31:34
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
难道全部是包涵体形式存在的？
这样试试看，我一般是这么诱导的：
37度摇到 OD600=0.6。然后加入0.1mM 和1.0mM ,同时摇两瓶，这时候的温度换成25-30度之间的某个都可以。还没有跑SDS-PAGE没有出来条带的时候呢。

祝好运
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
2楼2009-08-26 22:20:13
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忘记将来

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
一般这个条件诱导不出来，就要考虑换载体了
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3楼2009-08-26 22:26:19
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Apfel

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by Apfel at 2009-8-26 21:31:
我的目的基因的大小事1200多，克隆载体测序，表达载体测序都没有问题，可是用IPTG诱导的时候就是没有目的条带出来，我的载体是PET-21，诱导的条件是：37°C，IPTG浓度是1mM，做了好多次了，就是没有目的条带的出现 ...

我试一下吧，谢谢。
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4楼2009-08-26 23:04:53
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Apfel

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2009-8-26 22:20:
难道全部是包涵体形式存在的？
这样试试看，我一般是这么诱导的：
37度摇到 OD600=0.6。然后加入0.1mM 和1.0mM ,同时摇两瓶，这时候的温度换成25-30度之间的某个都可以。还没有跑SDS-PAGE没有出来条带的时候呢。 ...

谢谢您的建议。
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5楼2009-08-26 23:05:14
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gogen

金虫 (小有名气)
IPTG浓度要做个梯度实验,然后看看,把沉淀跑一下看看是不是都包涵体了...如果是的,那么,降温吧,可以考虑OD0.8,然后15度诱导表达这个秘籍,哈哈至于南农大的4度诱导表达的葵花宝典我就不说了真核的吗?真核的不少是要沉的...
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6楼2009-08-26 23:36:12
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Apfel

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by gogen at 2009-8-26 23:36:
IPTG浓度要做个梯度实验,然后看看,把沉淀跑一下看看是不是都包涵体了...如果是的,那么,降温吧,可以考虑OD0.8,然后15度诱导表达这个秘籍,哈哈至于南农大的4度诱导表达的葵花宝典我就不说了真核的吗?真核的不少 ...

IPTG的浓度梯度我也做过，分别为0.1mM,0.4mM,0.8mM,1.0mM,可是也没有诱导出来，我做的是原核表达。
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7楼2009-08-26 23:48:11
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Apfel

新虫 (小有名气)
另外30°C的诱导我也试过了，也没有诱导出来。很郁闷啊。
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8楼2009-08-26 23:50:48
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goodwish

木虫 (正式写手)

木虫书呆子
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
蛋白表达是需要不断摸索的，诱导时间、温度、IPTG浓度对蛋白表达都有影响。不断尝试之后还不表达可以尝试更换菌株（如Rosetta等），还不行就更换载体从头再来。如果都不行就改用真核表达（酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞等）吧。
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生命的海洋里，我是蓝色的一滴
9楼2009-08-27 00:33:40
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xiajungang

银虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
降低温度，降低诱导剂的量，比较好用
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吃苦耐劳，勇于创新，乐观热情，积极向上！
10楼2010-07-12 17:19:51
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