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幸福守候

新虫 (初入文坛)

[求助] 蛋白诱导纯化

我做的重组大肠杆菌的诱导表达纯化蛋白  收集的蛋白在用镍柱纯化后  跑电泳进行检测  只有破碎液和过柱之后收集的样品中出现的目的蛋白  后面冲洗和洗脱什么都没有  之前做的相同的条件可以跑出来目的蛋白的条带的  想请教一下是不是我的柱子挂不上蛋白了  什么情况下表明柱子挂不上蛋白
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1楼 2012-08-04 15:26:55
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lxh502976898

金虫 (小有名气)
你的破碎液里有目的蛋白 说明是形成包涵体 ，目的蛋白应该先挂在柱子上 然后洗脱出现峰 你接管就是了 我没看懂你说的过柱后能收集到样品是什么意思
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2楼2012-08-13 15:00:40
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xbl3688

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

破碎上清里有蛋白，说明不是因为包涵体（包涵体在离心后一般在沉淀中）；
过柱后流出的穿透液包含目的蛋白，而washing和elution步骤都没有蛋白，我理解没错吧。我觉得可能有几个原因：一，镍柱没有充电或没有充好电（在上样前加Ni2+），导致组氨酸标签挂不到柱子上；二，柱子出现问题，破了或是怎样，上的样品都流失了（这种可能比较小，如果漏了填料也会没了的）；三，设计载体上组氨酸标签出了问题。
一个个排除试试吧。
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生活的乐趣在于善于发现美，学会欣赏美
3楼2012-08-14 09:35:36
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