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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 蛋白诱导表达
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lxh502976898

金虫 (小有名气)

[求助] 蛋白诱导表达

我最近构建了表达载体，酶切鉴定也合格，加IPTG诱导后没有又到处目的蛋白条带，急需帮助。。。。。
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1楼 2012-10-17 11:22:39
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
15楼: Originally posted by lxh502976898 at 2012-10-20 14:08:29
大哥 你能不能一次性说完  出现不表达的可能性原因，...

不同物种的密码子偏好不同。比如说人或者植物的密码子使用和原核生物的不大一样。你要把目的基因按照菌的密码子翻译，看看和序列与原来的氨基酸序列是否一样。而且，如果使用了菌稀有的密码子，表达效率会很差。
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16楼2012-10-21 02:15:16
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普通回帖

yongbo_liang

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你换个载体或是表达菌株尝试一下。
应该是两者不相容
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2楼2012-10-17 11:26:39
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xiayongxiu

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-10-17 14:51:08
首先，确认你的表达载体的启动子，看是否是通过IPTG诱导的；其次是筛选诱导培养的条件，包括IPTG的量、诱导温度、转速等等；还有就是诱导蛋白纯化过程了，有的蛋白是以包涵体的形式存在，所以还得注意了。
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一切都要靠自己努力
3楼2012-10-17 11:31:37
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lxh502976898

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by xiayongxiu at 2012-10-17 11:31:37
首先，确认你的表达载体的启动子，看是否是通过IPTG诱导的；其次是筛选诱导培养的条件，包括IPTG的量、诱导温度、转速等等；还有就是诱导蛋白纯化过程了，有的蛋白是以包涵体的形式存在，所以还得注意了。

能确定是IPTG诱导，我是打算先诱导一下，确定能否能表达之后再优化条件，
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4楼2012-10-17 15:31:20
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lxh502976898

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yongbo_liang at 2012-10-17 11:26:39
你换个载体或是表达菌株尝试一下。
应该是两者不相容

那不是一天两天的事啊
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5楼2012-10-17 15:32:45
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你说没有诱导出来是用的总蛋白还是可溶蛋白，有时候诱导出的蛋白直接形成包涵体了。
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6楼2012-10-18 09:06:10
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lxh502976898

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-18 09:06:10
你说没有诱导出来是用的总蛋白还是可溶蛋白，有时候诱导出的蛋白直接形成包涵体了。

包涵体这事我知道，我的加完诱导剂诱导后，取1ml菌液离心，上清和沉淀都做电泳 按理说诱导出来的蛋白应该在沉淀里啊  然后再进行裂解 看是否形成包涵体
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7楼2012-10-19 08:50:24
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by lxh502976898 at 2012-10-19 08:50:24
包涵体这事我知道，我的加完诱导剂诱导后，取1ml菌液离心，上清和沉淀都做电泳 按理说诱导出来的蛋白应该在沉淀里啊  然后再进行裂解 看是否形成包涵体...

虽然多数情况目的蛋白是在菌体里，少数情况也会分泌到胞外。你说的没有是菌体里没有，还是菌体上清都没有呢？还有你用的是什么表达载体？确定目的蛋白前没有信号肽？
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8楼2012-10-19 08:57:06
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lxh502976898

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-19 08:57:06
虽然多数情况目的蛋白是在菌体里，少数情况也会分泌到胞外。你说的没有是菌体里没有，还是菌体上清都没有呢？还有你用的是什么表达载体？确定目的蛋白前没有信号肽？...

原核表达 载体pet30a 菌体和上清都没有特异性条带 目的蛋白如果有信号肽会出现什么情况 我从全基因合成到载体构建 都是送到外面生化公司做的 只是回来做个酶切鉴定 然后诱导表达和纯化 以及后续活性实验
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9楼2012-10-19 15:50:04
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狐狸尾巴

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你应该说清楚是什么蛋白，用的是什么表达菌株，诱导剂浓度，诱导温度，诱导时间等等，这样别人才好给你解答
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10楼2012-10-19 16:28:51
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