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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 基因带六个his标签，蛋白纯化时为何挂不上镍柱
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stella0xhx

新虫 (小有名气)

[交流] 基因带六个his标签，蛋白纯化时为何挂不上镍柱 已有9人参与

克隆了一个肠激酶的基因，设计引物时加了６个his，蛋白可溶性还行，可是做蛋白纯化时，用的镍柱，但是目标蛋白就是挂不上柱，磷酸盐和tris-Hcl 的缓冲液都试过了，没法，请教各位高手，怎么办啊？
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1楼 2009-07-12 09:45:10
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

北国佳人

铜虫 (小有名气)

浅浅的指导以下

★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1.标蛋白是否表达HIS 标签..
2. 柱子是新的还是以前用过的,旧的应该很好的处理一下,
3.缓冲液很重要,蛋白与柱子结合是靠离子螯合,反应环境很重要
好好做好每一步!
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努力的小蜜蜂
5楼2009-07-12 11:31:47
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秀才ecust

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
binding buffer不要含咪唑，直接上样，再用低浓度的洗脱试下！保证成功！
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19楼2010-12-06 20:19:41
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璧月

捐助贵宾 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
重组表达的蛋白结构不一定是正确的，尿素变性后可以复性的。
我们这边出现过做着做着，挂不上柱了。重新取保的菌种做，又能挂上了。之前挂不上应该是菌种退化了。

[ 发自小木虫客户端 ]
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26楼2014-09-23 20:33:41
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普通回帖

zplipeng

金虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
不懂啊。。。。
等待高人回答
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加油哦↖(^ω^)↗，O(∩_∩)O哈哈~
2楼2009-07-12 09:47:04
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txstbbm

铁虫 (小有名气)
★ ★
amisking(金币+2,VIP+0):欢迎发帖交流！ 7-12 10:51
可能情况：
1，ORF不完整或者不是预期的ORF，His没表达出来
2，His被空间结构所掩盖，建议变性后再过柱
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3楼2009-07-12 09:49:01
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cloudy3197

银虫 (小有名气)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+1,VIP+0):欢迎发帖交流！ 7-12 11:27
同一ls，可能跟蛋白空间结构有关，变性后再上柱。

另外，是否是柱子本身的问题，也可以重新脱镍挂镍后再看看~~
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4楼2009-07-12 11:18:22
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stella0xhx

新虫 (小有名气)
首先感谢各位的解答啊！不过问题还是没有解决。那个重组基因是测过序的，没有内含子的，也做过SDS－凝胶蛋白电泳，蛋白表达正确且可溶性也好，就是做纯化，挂不上柱，我想得到的是纯化后有活性的蛋白，因为后续还要做其它的用。所以不能变性后挂柱啊！各位还有什么高招啊？小妹先谢过了。
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6楼2009-07-13 23:22:32
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)
用其它纯化手段
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7楼2009-07-14 08:00:11
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anik

银虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
有可能是你的his 标签掉了，另一个就是你的镍柱没有还原彻底。
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8楼2009-07-14 08:01:49
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wjswj

木虫 (正式写手)

小木虫领金币专业户
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
曾经傻乎乎的用TE缓冲液溶蛋白去挂镍柱，结果……后来想想真好笑：）
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金币是赌出来的
9楼2009-07-14 08:49:09
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txstbbm

铁虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
这样呀，不变形的话也可以尝试做个活性蛋白电泳，然后切胶回收吧!
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10楼2009-07-14 09:06:45
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