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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 基因带六个his标签，蛋白纯化时为何挂不上镍柱
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peng5053

银虫 (正式写手)

Dr.
我建议你做一个正对照，用一个完好的his标签的蛋白去做纯化，在通过你的结果去分析问题到底出在那个地方！
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多点思维，多点idea
11楼2009-07-14 15:27:59
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tiani_tan

金虫 (小有名气)
★
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用western验证一下是否有该标签，看一下缓冲液里有没有能够和ni结合的物质
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12楼2009-07-14 16:04:37
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lsbrc

银虫 (小有名气)
★
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1.首选确定你的His融合是可溶性表达；
2.确定你的Ni株没有问题，注意Ni有没有掉下来，建议对Ni柱进行清洗，然后再生。
3.改变Binding Buffer的pH（在不影响活性情况下，建议提高pH可增加Ni的亲和力）、盐浓度、添加Triton、NP40等；
4.细胞裂解尤其是超声波不能太剧烈，我们发现His与Ni不结合往往是超声太剧烈导致蛋白变性l；
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13楼2009-07-14 16:28:38
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stella0xhx

新虫 (小有名气)
再次感谢各位的建议，我准备做个蛋白变性，再纯化，后复性，
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14楼2009-07-14 22:51:44
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wolfebst

至尊木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
这个情况我也遇到过
我最后是将组氨酸标签融合到了基因序列的后面
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15楼2009-07-15 00:40:27
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jerryqpr

木虫 (正式写手)

小猪亲点的老公
★
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1，western检验一下你的蛋白是不是有his标签
2，你的镍柱是不是有问题，是否需要再生了再用
3，你设计引物加入his标签的时候是否有误，6个his密码子不能是一样的，如果his标签设计在c端的话很可能这些his没有表达出来。
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铁杵可以磨成针,木杵只能磨成牙签,有些事情不是努力可以改变的.
16楼2009-07-15 00:59:53
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ly888lsp

木虫 (小有名气)
★
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1，ORF不完整或者不是预期的ORF，His没表达出来
2，His被空间结构所掩盖，建议变性后再过柱
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17楼2009-07-15 08:24:02
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一只鱼ddtt

银虫 (小有名气)
★
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你的蛋白表达是在包涵体中表达吗？是的话那就必须先变性，如果以后要用有活性的蛋白，那你就得进行复性后再用。另外可能是你的镍没有挂好。
只是个小建议，说的不对还请指教。
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做个有风度的人
18楼2009-07-16 13:31:41
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秀才ecust

新虫 (初入文坛)
★
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binding buffer不要含咪唑，直接上样，再用低浓度的洗脱试下！保证成功！
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19楼2010-12-06 20:19:41
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)
加大盐浓度。
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VX：19192310212；公众号：生物技术与IVD
20楼2010-12-06 21:40:51
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