基因带六个his标签，蛋白纯化时为何挂不上镍柱 - 生物科学 - 第2页小木虫论坛-学术科研互动平台

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peng5053

银虫 (正式写手)

Dr.

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我建议你做一个正对照，用一个完好的his标签的蛋白去做纯化，在通过你的结果去分析问题到底出在那个地方！

多点思维，多点idea

11楼2009-07-14 15:27:59

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tiani_tan

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用western验证一下是否有该标签，看一下缓冲液里有没有能够和ni结合的物质

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12楼2009-07-14 16:04:37

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lsbrc

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1.首选确定你的His融合是可溶性表达；
2.确定你的Ni株没有问题，注意Ni有没有掉下来，建议对Ni柱进行清洗，然后再生。
3.改变Binding Buffer的pH（在不影响活性情况下，建议提高pH可增加Ni的亲和力）、盐浓度、添加Triton、NP40等；
4.细胞裂解尤其是超声波不能太剧烈，我们发现His与Ni不结合往往是超声太剧烈导致蛋白变性l；

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13楼2009-07-14 16:28:38

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stella0xhx

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再次感谢各位的建议，我准备做个蛋白变性，再纯化，后复性，

14楼2009-07-14 22:51:44

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wolfebst

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这个情况我也遇到过
我最后是将组氨酸标签融合到了基因序列的后面

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15楼2009-07-15 00:40:27

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jerryqpr

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1，western检验一下你的蛋白是不是有his标签
2，你的镍柱是不是有问题，是否需要再生了再用
3，你设计引物加入his标签的时候是否有误，6个his密码子不能是一样的，如果his标签设计在c端的话很可能这些his没有表达出来。

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铁杵可以磨成针,木杵只能磨成牙签,有些事情不是努力可以改变的.

16楼2009-07-15 00:59:53

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ly888lsp

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1，ORF不完整或者不是预期的ORF，His没表达出来
2，His被空间结构所掩盖，建议变性后再过柱

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17楼2009-07-15 08:24:02

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一只鱼ddtt

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你的蛋白表达是在包涵体中表达吗？是的话那就必须先变性，如果以后要用有活性的蛋白，那你就得进行复性后再用。另外可能是你的镍没有挂好。
只是个小建议，说的不对还请指教。

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做个有风度的人

18楼2009-07-16 13:31:41

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秀才ecust

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binding buffer不要含咪唑，直接上样，再用低浓度的洗脱试下！保证成功！

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19楼2010-12-06 20:19:41

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snoopyzxx

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加大盐浓度。

生物资源交流QQ群：1044518333

20楼2010-12-06 21:40:51

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