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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 基因带六个his标签，蛋白纯化时为何挂不上镍柱
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wurenzhi0721

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
13750061楼: Originally posted by wjswj at 2009-07-14 08:49:09:
曾经傻乎乎的用TE缓冲液溶蛋白去挂镍柱，结果……后来想想真好笑：）

有才
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你快乐所以我快乐，我快乐所以大家也快乐
21楼2012-05-03 19:44:53
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edoz1986

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
1 你的破碎buffer是什么？有没有dtt和arg？
2 你可以把你的蛋白透析他偶8m尿素中（当然是小试），打开成直链，再挂镍柱，这样就可以判断是不是你的his标签折叠到分子内部去了
3 可以做一个his的westernblot  看看有没有信号
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22楼2013-05-23 14:53:19
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huijhruby

木虫 (正式写手)
★
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引用回帖:
13楼: Originally posted by lsbrc at 2009-07-14 16:28:38
1.首选确定你的His融合是可溶性表达；
2.确定你的Ni株没有问题，注意Ni有没有掉下来，建议对Ni柱进行清洗，然后再生。
3.改变Binding Buffer的pH（在不影响活性情况下，建议提高pH可增加Ni的亲和力）、盐浓度、添 ...

想问一下，你说到了超声剧烈导致蛋白变性，这里的变性和用8M尿素变性是差不多的吗？我在纯化包涵体，但是好像也是没有和镍柱结合太多，洗脱下来有东西，但就是太少太少了。不知道是不是你说的超声剧烈导致的HIS和NI不结合，电泳时候过柱前和过柱后都有挺多目的蛋白，不知道超声剧烈导致的蛋白变性和正常情况在电泳时有没有什么差异呢？
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23楼2013-06-05 16:35:13
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929519755

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我以前也碰到过这样的蛋白，与蛋白的性质有关。亲和不行，可以考虑一下别的纯化方法。还有，你亲和时用的是Ni柱，有条件的话，可以尝试用钴 柱。
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想你没话说
24楼2013-08-14 14:15:25
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dongmings

木虫之王 (文学泰斗)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
也许蛋白折叠His在蛋白内部吧，试试把His放在蛋白的另一侧
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25楼2014-09-23 20:10:02
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璧月

捐助贵宾 (正式写手)
★
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重组表达的蛋白结构不一定是正确的，尿素变性后可以复性的。
我们这边出现过做着做着，挂不上柱了。重新取保的菌种做，又能挂上了。之前挂不上应该是菌种退化了。

[ 发自小木虫客户端 ]
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26楼2014-09-23 20:33:41
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langzian

木虫 (正式写手)
低ph结合液试试
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江山
27楼2014-09-24 16:37:25
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