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stella0xhx

新虫 (小有名气)

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[交流] 基因带六个his标签，蛋白纯化时为何挂不上镍柱已有9人参与

克隆了一个肠激酶的基因，设计引物时加了６个his，蛋白可溶性还行，可是做蛋白纯化时，用的镍柱，但是目标蛋白就是挂不上柱，磷酸盐和tris-Hcl 的缓冲液都试过了，没法，请教各位高手，怎么办啊？

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1楼2009-07-12 09:45:10

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huijhruby

木虫 (正式写手)

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引用回帖:

13楼: Originally posted by lsbrc at 2009-07-14 16:28:38
1.首选确定你的His融合是可溶性表达；
2.确定你的Ni株没有问题，注意Ni有没有掉下来，建议对Ni柱进行清洗，然后再生。
3.改变Binding Buffer的pH（在不影响活性情况下，建议提高pH可增加Ni的亲和力）、盐浓度、添 ...

想问一下，你说到了超声剧烈导致蛋白变性，这里的变性和用8M尿素变性是差不多的吗？我在纯化包涵体，但是好像也是没有和镍柱结合太多，洗脱下来有东西，但就是太少太少了。不知道是不是你说的超声剧烈导致的HIS和NI不结合，电泳时候过柱前和过柱后都有挺多目的蛋白，不知道超声剧烈导致的蛋白变性和正常情况在电泳时有没有什么差异呢？