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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 基因带六个his标签，蛋白纯化时为何挂不上镍柱
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stella0xhx

新虫 (小有名气)

[交流] 基因带六个his标签，蛋白纯化时为何挂不上镍柱 已有9人参与

克隆了一个肠激酶的基因，设计引物时加了６个his，蛋白可溶性还行，可是做蛋白纯化时，用的镍柱，但是目标蛋白就是挂不上柱，磷酸盐和tris-Hcl 的缓冲液都试过了，没法，请教各位高手，怎么办啊？
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1楼 2009-07-12 09:45:10
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edoz1986

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
1 你的破碎buffer是什么？有没有dtt和arg？
2 你可以把你的蛋白透析他偶8m尿素中（当然是小试），打开成直链，再挂镍柱，这样就可以判断是不是你的his标签折叠到分子内部去了
3 可以做一个his的westernblot  看看有没有信号
赞一下 回复此楼
22楼2013-05-23 14:53:19
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zplipeng

金虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
不懂啊。。。。
等待高人回答
赞一下(1人) 回复此楼
加油哦↖(^ω^)↗，O(∩_∩)O哈哈~
2楼2009-07-12 09:47:04
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txstbbm

铁虫 (小有名气)
★ ★
amisking(金币+2,VIP+0):欢迎发帖交流！ 7-12 10:51
可能情况：
1，ORF不完整或者不是预期的ORF，His没表达出来
2，His被空间结构所掩盖，建议变性后再过柱
赞一下(10人) 回复此楼
3楼2009-07-12 09:49:01
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cloudy3197

银虫 (小有名气)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+1,VIP+0):欢迎发帖交流！ 7-12 11:27
同一ls，可能跟蛋白空间结构有关，变性后再上柱。

另外，是否是柱子本身的问题，也可以重新脱镍挂镍后再看看~~
赞一下(11人) 回复此楼
4楼2009-07-12 11:18:22
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