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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 转化感受态细胞，平板筛选不长菌？
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药娘子

新虫 (小有名气)

[求助] 转化感受态细胞，平板筛选不长菌？ 已有5人参与

将提取的质粒（卡那抗性）转到BL21，阴性对照和实验组都没长菌，其中用到的BL21是课题组其他同学曾成功转化的，质粒的浓度是13.7ng/微升，10微升质粒对50微升BL21，接下来我要怎样修改实验方案才能转化成功？求给建议

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1楼 2017-09-22 09:06:29
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

原来，是这样

金虫 (小有名气)
★ ★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2018-01-09 21:43:49
drwhoknowss: 金币+1, 可行 2018-02-08 04:02:28
你拿个阳性质粒再转化试试，看看转化效率怎么样，感受态到底失活没有。如果没有那就是你转化步骤哪一步出问题了，可以把你的转化步骤发一下，给你参考参考。

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4楼2017-09-22 09:15:22
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ytt1109

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 药娘子 at 2017-09-22 09:13:06
感受态细胞保存于-80℃，一般来说，50微升感受态细胞不是对应50-100ng的质粒吗？
...

正常情况下质粒加多了只会引起长的菌斑密度增加，不会不长菌，所以感受态失活的可能行比较大吧，换一下感受态吧，我最近做转化老不长菌，换了感受态就解决了哈。
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好好学习，天天向上。
12楼2017-11-04 22:06:48
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wwbqzhj

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
drwhoknowss: 金币+1, 鼓励交流 2018-02-08 04:02:38
感受态怎么保存的，放了多久？质粒用量太大了吧，一般质粒用1~3ul就够了
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2楼2017-09-22 09:10:48
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原来，是这样

金虫 (小有名气)
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2018-01-09 21:42:45
引用回帖:
5楼: Originally posted by 药娘子 at 2017-09-22 09:37:45
谢谢您。转化步骤是
1 无菌台中，于冰上，分别取50微升的BL21 和10微升质粒加到Ep管中  
2 冰上放置30min
3 42℃热激45s
4 冰上放置1-2min
5 无菌台中，加入500微升37℃预热好的LB培养基，200rpm, 1h, 37℃
6 浓缩 ...

你的感受态为什么要吸取50ul，一般不都是50ul或者100ul分装一个ep管的么。步骤没有什么大问题，我一般热激90s。从你的步骤看来很大概率是感受态不行了。

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6楼2017-09-22 09:51:19
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原来，是这样

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 药娘子 at 2017-09-22 10:10:48
对啊！100微升一管，取出50微升。我也怀疑是感受态细胞的问题，所以换了一个曾成功转化的感受态，但也没有长，是不是我自已的问题啊
...

操作问题不大可能，那质粒确定没问题吗

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9楼2017-09-22 11:43:56
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小阳sunny

新虫 (初入文坛)
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2018-01-09 21:43:01
质粒的量太多了了吧，热激时间有点短，一般是90s。不过这个应该不是问题。阴性对照和空白对照由于BL21菌株没有抗性所以不会长的。建议拿一个确定正常的质粒和一个确定没问题的感受态细胞分别做阳性对照。看下是你的质粒有问题还是BL21感受态细胞有问题

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快乐做研究!
10楼2017-09-22 12:00:47
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mfl梅凤玲

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2018-01-09 21:43:16
实验步骤没什么大问题，如果建议换感受态试试，你的质粒是用Nanodrop测的浓度吗？峰型怎么样，如果换感受态还是没有效果就可能是质粒的问题，建议重新提质粒
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11楼2017-09-29 09:12:47
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思之诚之

新虫 (正式写手)
初看后，两个建议：一是质粒浓度有点低，一般地，最少也有好几十纳克每微升，你可以考虑重提质粒；二是，可能这一批感受态有问题，不好；三是，其它不明原因，生物实验就是这样，如果不能反思出明显出错的地方，建议还是认真严谨地再重做，不要纠结于失败原因，因为很多永远也搞不清楚的。祝好！

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14楼2018-01-05 00:10:09
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普通回帖

药娘子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wwbqzhj at 2017-09-22 09:10:48
感受态怎么保存的，放了多久？质粒用量太大了吧，一般质粒用1~3ul就够了

感受态细胞保存于-80℃，一般来说，50微升感受态细胞不是对应50-100ng的质粒吗？

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3楼2017-09-22 09:13:06
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药娘子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 原来，是这样 at 2017-09-22 09:15:22
你拿个阳性质粒再转化试试，看看转化效率怎么样，感受态到底失活没有。如果没有那就是你转化步骤哪一步出问题了，可以把你的转化步骤发一下，给你参考参考。

谢谢您。转化步骤是
1 无菌台中，于冰上，分别取50微升的BL21 和10微升质粒加到Ep管中  
2 冰上放置30min
3 42℃热激45s
4 冰上放置1-2min
5 无菌台中，加入500微升37℃预热好的LB培养基，200rpm, 1h, 37℃
6 浓缩: 没有在无菌台，6000rpm 3min离心，然后取出400微升，余下的160微升重悬，
7 涂平板: 无菌台中，用余下的160微升涂平板，（氨苄抗性，卡那抗性各涂了一个）
阴性对照: 无菌水代替了质粒
空白对照:什么都没加
实验结果: 所以平板都没有长
求建议。谢谢

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5楼2017-09-22 09:37:45
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药娘子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 原来，是这样 at 2017-09-22 09:51:19
你的感受态为什么要吸取50ul，一般不都是50ul或者100ul分装一个ep管的么。步骤没有什么大问题，我一般热激90s。从你的步骤看来很大概率是感受态不行了。
...

对啊！100微升一管，取出50微升。我也怀疑是感受态细胞的问题，所以换了一个曾成功转化的感受态，但也没有长，是不是我自已的问题啊

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7楼2017-09-22 10:10:48
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mhhhwcf059

新虫 (著名写手)
ding   支持
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8楼2017-09-22 11:10:54
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