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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助关于制备枯草芽孢杆菌感受态的经验
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杨柳依依625

铁虫 (小有名气)

[求助] 求助关于制备枯草芽孢杆菌感受态的经验已有1人参与

通过查资料和浏览小木虫，得到了几种制备枯草感受态的方法，但实验了若干次总是失败，还经常出现感受态污染，甚至没有转化的对照组也能长出菌来。
我所用的抗生素是红霉素，因为一直没有好的效果，所以一直在做浓度梯度：0.4、4、5、6、7、8、10μg/ml。
以下是我所用的各种方法：
一、1、菌种在斜面培养2天，孢子形成率接近100%。
       2、接于5ml GMⅠ溶液，在30℃慢摇床（100rpm）振荡培养过夜。
       3、次日取2ml转接到18ml GMⅠ中，37℃快摇床（200rpm）培养3.5小时。
       4、再取10ml转接到90ml GMⅡ中，37℃慢摇床培养90分钟，离心收集菌体。
       5、用10ml上清液悬浮菌体，并加30%的灭菌甘油至10%，混匀后分装到离心管中（0.5ml/Tube），随即放到-70℃保存。
       6、转化时取出离心管，放在45℃水浴中溶化，然后在0.5ml菌液中加入适量DNA（1ug/ml）。
       7、于37℃缓慢振荡（80rpm）保温30分钟后涂抗性平板，再在37℃培养过夜，次日检查转化子。
      【培养基配方】
        1.10×最低盐溶液：K2HPO4 14g（K2HPO4.3H2O 18.34g），KH2PO4 6g，(NH4)2SO4 2g，柠檬酸钠（Na3C6H5O7.2H2O）1g，MgSO4.7H2O 0.2g，在蒸馏水中依  次溶解，加水至100ml。
        2.L- trp溶液，2mg/ml，贮于棕色瓶内，113℃灭菌30min，用黑纸包裹。
        3.GMⅠ溶液：1×最低盐溶液95ml，50%葡萄糖1ml，5%水解酪蛋白0.4ml，10%酵母汁1ml，2mg/ml L- trp 2.5ml（50ug/ml）。
        4.GMⅡ溶液：1×最低盐溶液97.5ml，50%葡萄糖1ml，5%水解酪蛋白0.08ml，10%酵母汁0.04ml，0.5M MgCl2 0.5ml(2.5mM)，0.1M CaCl2 0.5ml(0.5mM)，2mg/ml L- trp 0.5ml（5ug/ml）。
        于37℃缓慢振荡（80rpm）保温30分钟后涂抗性平板，再在37℃培养过夜，次日检查转化子。
        ★ ”次日取2ml转接到18ml GMⅠ中，37℃快摇床（200rpm）培养3.5小时“，我看有人说这一步大概养到OD600为0.85-0.95，但是我做的大概在2.5小时的时候就已经OD600为1.28了。整个人就凌乱了。这种比较笼统的表述对于我这种新手来说真心是个挑战，有没有哪位大神知道具体的信息？

二、1.  准备新鲜的168 单克隆平板，取一满环枯草芽孢杆菌甘油菌划LB 平板，37°C 培养箱培养12 h。
       2.  转化前一天晚间挑单菌落至3 ml LB 培养基中，37°C，250 r/min 培养过夜。
       3.  第二天上午取160 μl 培养液转接至8 ml SPI 培养基中，37°C，250 r/min 培养至对数生长末期(168 约4-5 h)。
       4.  取0.2 ml 生长至对数期末的培养液至2 ml SPII 培养基中，37 °C，100 r/min 培养90 分钟。
       5.  在上述SPII培养基的菌体中加入20 μl 10mmol/L EGTA，再于37°C，100 r/min 培养10 分钟。
       6.  将上述处理后的菌液分装成0.5 ml 每管，各加入5 μl DNA(DNA 量不能过高，不超过5 μg)，再于37 °C，250 r/min 培养90 分钟，取菌液涂布筛选平板。
      【培养基配方】
      1.  SP 盐：0.2%( NH4 )2SO4，1.4% K2HPO4，0.6% KH2PO4， 0.02% MgSO4·7H2O， 0.1% 柠檬酸钠。
      2.  CAYE (100×)：2 % Casamino acid，10%酵母膏。
      3.  SPI 培养基：SP 盐溶液加入1 %体积浓度为50%葡萄糖溶液，1 %体积100×CAYE 溶液。
      4.  SPII 培养基：SPI 培养基加入1 %体积50 mmol/L CaCl2 溶液，1 %体积250 mmol/L MgCl2 溶液。
      5.  SP-A Salts Solution(500 ml)：0.4% (NH4)2SO4 ：2 g    2.8% K2HPO4·3H2O ：14 g    1.2% KH2PO4 ：6 g    0.2% Trisodium Citrate Dihydrate ：1g   
           121°C灭菌20 min。
      6.  SP-B Salts Solution(500 ml)：0.04% MgSO4·7H2O： 0.2 g    121°C灭菌20 min。
      7.  100×CAYE Solution(100 ml)：2% Casamino acid ：2 g    10% Yeast Extract：10 g     121°C灭菌20 min。
      8.  SPI Medium(20 mL)： SP-A Salts Solution：9.8 mL     SP-B Salts Solution：9.8 mL    (1%V)Glucose(50%w/v，115°C灭菌20 min) ：200 μL     (1%V)100×CAYE：200 μL
     10.  SPII Medium(6 mL)：SPI Medium：5.88mL    (1%V)50mM CaCl2 ：60μL    (1%V)250mM MgCl2：60μL
     11.  100×EGTA Solution：10mmol/L EGTA 溶液，溶解时需加少量NaOH 至pH8.0。

三、① 取冻存的B.subtilis 一环，在LB 平板上划线，37℃培养过夜活化。
       ② 挑取单菌落接种于5ml LB 液体培养基中，37℃培养过夜培养（18h）。
       ③ 取一定量的过夜培养物到4.5ml的Medium A 中，使OD650 值到达0.1-0.2，留下4.5ml 混合菌液。
       ④ 37℃ 200rpm 振荡培养，每个20min 测一次OD650，当OD650 到达0.4-0.6（大约需要60-90min）时记时为t0。
       ⑤ 继续振荡培养90min，计时为t90，吸取0.05ml 菌液至存有0.45ml 预热的Medium B 的无菌试管中；
       ⑥ 37℃振荡90min，此时培养物中有很多感受态细胞形成；
       ⑦ 加1μg 的质粒（15-20ul），37℃振荡培养30min。
       ⑧ 离心去除大部分的上清液，重悬细胞，涂在含有相应抗生素的筛选平板上，37℃培养过夜
       ★ 这种方法我是从第4步开始每隔20min就测OD650，一直到基本稳定了，换成对数值后选取对数期生长率的拐点作为t0，90min后也差不多就是对数末期了，但这种方法因为需要一直测吸光度，所以我的感受态经常污染，而且也没有转化成功。

基本就是这三种方法了，因为我们实验室没有做过枯草的系统，所以很多都是我自己摸索的，比较笨，各位大神不喜勿喷。
我想肯定是有些关键点我没有Get到，一直陷在沼泽之中无法自拔。
望各位大神能倾囊相助，提供一些你们成功的经验，为小女子指点迷津，我将不胜感激！
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1楼2015-05-09 13:28:08
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

杨柳依依625

铁虫 (小有名气)
昨天做的一批感受态还是不行，没做转化的平板也有菌，有的形态是和枯草一样，有的根本就不一样，应该是因为污染，但是枯草也长出来是几个意思啊？好凌乱
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3楼2015-05-10 08:58:15
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杨柳依依625

铁虫 (小有名气)
现在不是转化不成功的问题，主要是我的阴性对照也在抗性平板上长，这是我最大的疑惑
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4楼2015-05-10 09:05:51
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liygmail

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-05-10 22:57:04
杨柳依依625: 金币+10, ★有帮助 2015-05-12 14:14:42
引用回帖:
4楼: Originally posted by 杨柳依依625 at 2015-05-10 09:05:51
现在不是转化不成功的问题，主要是我的阴性对照也在抗性平板上长，这是我最大的疑惑

枯草芽孢杆菌营养递减两步法，一般步骤：
首先，菌体在丰富培养基上生长到对数期末或稳定期初期（可定期检测OD)，转接贫乏培养基，生长至对数期末或稳定期初期（可定期检测OD)，此时感受态效果最好。个人理解，实验环节中，某些protocol的操作参数（例如培养几小时或90min），对于不同的具体培养条件以及不同菌株，具体参数应有所差异，不宜机械照搬。

ps：阴性对照抗性平板上也长，只能说明两点：一、操作有污染，二、抗生素失效了
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5楼2015-05-10 11:11:25
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普通回帖

杨柳依依625

铁虫 (小有名气)
大神都在哪里，求回复。。。
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2楼2015-05-10 08:30:52
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杨柳依依625

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by liygmail at 2015-05-10 11:11:25
枯草芽孢杆菌营养递减两步法，一般步骤：
首先，菌体在丰富培养基上生长到对数期末或稳定期初期（可定期检测OD)，转接贫乏培养基，生长至对数期末或稳定期初期（可定期检测OD)，此时感受态效果最好。个人理解，实 ...

谢谢你的回复
我想问下，对于枯草168，合适的OD值是多少呢？我一直没找到这方面的数据，个人也任务单纯的说培养多少时间很不准确。
请问你有具体的protocol吗？
谢谢！
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6楼2015-05-10 12:33:59
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liygmail

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by 杨柳依依625 at 2015-05-10 12:33:59
谢谢你的回复
我想问下，对于枯草168，合适的OD值是多少呢？我一直没找到这方面的数据，个人也任务单纯的说培养多少时间很不准确。
请问你有具体的protocol吗？
谢谢！...

可以试一下http://2009.igem.org/Team:Newcas ... tocols/TransformBac
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7楼2015-05-10 15:12:49
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杨柳依依625

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by liygmail at 2015-05-10 15:12:49
可以试一下http://2009.igem.org/Team:Newcastle/Project/Labwork/OurProtocols/TransformBac...

谢谢，我看这个protocol也没有说具体的OD值，但步骤很详细，可以尝试一下
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8楼2015-05-10 16:07:11
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杨柳依依625

铁虫 (小有名气)
想问一下，对照组应该怎么设置，涂平板又该涂多少呢？
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9楼2015-05-11 19:17:24
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liygmail

至尊木虫 (职业作家)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 杨柳依依625 at 2015-05-11 19:17:24
想问一下，对照组应该怎么设置，涂平板又该涂多少呢？

设置阴性对照，感受态细胞0.4ml，转化时不加DNA或加水即可，
转化子数目与DNA和感受态细胞转化率相关，考虑到转化子数目可能较大，涂平板时，先取菌液100ul涂布，余下菌液再离心浓缩，去大部上清，余下100ul全涂
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10楼2015-05-11 22:47:43
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