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求助关于制备枯草芽孢杆菌感受态的经验 已有1人参与
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通过查资料和浏览小木虫，得到了几种制备枯草感受态的方法，但实验了若干次总是失败，还经常出现感受态污染，甚至没有转化的对照组也能长出菌来。 我所用的抗生素是红霉素，因为一直没有好的效果，所以一直在做浓度梯度：0.4、4、5、6、7、8、10μg/ml。 以下是我所用的各种方法： 一、1、菌种在斜面培养2天，孢子形成率接近100%。 2、接于5ml GMⅠ溶液，在30℃慢摇床（100rpm）振荡培养过夜。 3、次日取2ml转接到18ml GMⅠ中，37℃快摇床（200rpm）培养3.5小时。 4、再取10ml转接到90ml GMⅡ中，37℃慢摇床培养90分钟，离心收集菌体。 5、用10ml上清液悬浮菌体，并加30%的灭菌甘油至10%，混匀后分装到离心管中（0.5ml/Tube），随即放到-70℃保存。 6、转化时取出离心管，放在45℃水浴中溶化，然后在0.5ml菌液中加入适量DNA（1ug/ml）。 7、于37℃缓慢振荡（80rpm）保温30分钟后涂抗性平板，再在37℃培养过夜，次日检查转化子。 【培养基配方】 1.10×最低盐溶液：K2HPO4 14g（K2HPO4.3H2O 18.34g），KH2PO4 6g，(NH4)2SO4 2g，柠檬酸钠（Na3C6H5O7.2H2O）1g，MgSO4.7H2O 0.2g，在蒸馏水中依 次溶解，加水至100ml。 2.L- trp溶液，2mg/ml，贮于棕色瓶内，113℃灭菌30min，用黑纸包裹。 3.GMⅠ溶液：1×最低盐溶液95ml，50%葡萄糖1ml，5%水解酪蛋白0.4ml，10%酵母汁1ml，2mg/ml L- trp 2.5ml（50ug/ml）。 4.GMⅡ溶液：1×最低盐溶液97.5ml，50%葡萄糖1ml，5%水解酪蛋白0.08ml，10%酵母汁0.04ml，0.5M MgCl2 0.5ml(2.5mM)，0.1M CaCl2 0.5ml(0.5mM)，2mg/ml L- trp 0.5ml（5ug/ml）。 于37℃缓慢振荡（80rpm）保温30分钟后涂抗性平板，再在37℃培养过夜，次日检查转化子。 ★ ”次日取2ml转接到18ml GMⅠ中，37℃快摇床（200rpm）培养3.5小时“，我看有人说这一步大概养到OD600为0.85-0.95，但是我做的大概在2.5小时的时候就已经OD600为1.28了。整个人就凌乱了。这种比较笼统的表述对于我这种新手来说真心是个挑战，有没有哪位大神知道具体的信息？ 二、1. 准备新鲜的168 单克隆平板，取一满环枯草芽孢杆菌甘油菌划LB 平板，37°C 培养箱培养12 h。 2. 转化前一天晚间挑单菌落至3 ml LB 培养基中，37°C，250 r/min 培养过夜。 3. 第二天上午取160 μl 培养液转接至8 ml SPI 培养基中，37°C，250 r/min 培养至对数生长末期(168 约4-5 h)。 4. 取0.2 ml 生长至对数期末的培养液至2 ml SPII 培养基中，37 °C，100 r/min 培养90 分钟。 5. 在上述SPII培养基的菌体中加入20 μl 10mmol/L EGTA，再于37°C，100 r/min 培养10 分钟。 6. 将上述处理后的菌液分装成0.5 ml 每管，各加入5 μl DNA(DNA 量不能过高，不超过5 μg)，再于37 °C，250 r/min 培养90 分钟，取菌液涂布筛选平板。 【培养基配方】 1. SP 盐：0.2%( NH4 )2SO4，1.4% K2HPO4，0.6% KH2PO4， 0.02% MgSO4·7H2O， 0.1% 柠檬酸钠。 2. CAYE (100×)：2 % Casamino acid，10%酵母膏。 3. SPI 培养基：SP 盐溶液加入1 %体积浓度为50%葡萄糖溶液，1 %体积100×CAYE 溶液。 4. SPII 培养基：SPI 培养基加入1 %体积50 mmol/L CaCl2 溶液，1 %体积250 mmol/L MgCl2 溶液。 5. SP-A Salts Solution(500 ml)：0.4% (NH4)2SO4 ：2 g 2.8% K2HPO4·3H2O ：14 g 1.2% KH2PO4 ：6 g 0.2% Trisodium Citrate Dihydrate ：1g 121°C灭菌20 min。 6. SP-B Salts Solution(500 ml)：0.04% MgSO4·7H2O： 0.2 g 121°C灭菌20 min。 7. 100×CAYE Solution(100 ml)：2% Casamino acid ：2 g 10% Yeast Extract：10 g 121°C灭菌20 min。 8. SPI Medium(20 mL)： SP-A Salts Solution：9.8 mL SP-B Salts Solution：9.8 mL (1%V)Glucose(50%w/v，115°C灭菌20 min) ：200 μL (1%V)100×CAYE：200 μL 10. SPII Medium(6 mL)：SPI Medium：5.88mL (1%V)50mM CaCl2 ：60μL (1%V)250mM MgCl2：60μL 11. 100×EGTA Solution：10mmol/L EGTA 溶液，溶解时需加少量NaOH 至pH8.0。 三、① 取冻存的B.subtilis 一环，在LB 平板上划线，37℃培养过夜活化。 ② 挑取单菌落接种于5ml LB 液体培养基中，37℃培养过夜培养（18h）。 ③ 取一定量的过夜培养物到4.5ml的Medium A 中，使OD650 值到达0.1-0.2，留下4.5ml 混合菌液。 ④ 37℃ 200rpm 振荡培养，每个20min 测一次OD650，当OD650 到达0.4-0.6（大约需要60-90min）时记时为t0。 ⑤ 继续振荡培养90min，计时为t90，吸取0.05ml 菌液至存有0.45ml 预热的Medium B 的无菌试管中； ⑥ 37℃振荡90min，此时培养物中有很多感受态细胞形成； ⑦ 加1μg 的质粒（15-20ul），37℃振荡培养30min。 ⑧ 离心去除大部分的上清液，重悬细胞，涂在含有相应抗生素的筛选平板上，37℃培养过夜 ★ 这种方法我是从第4步开始每隔20min就测OD650，一直到基本稳定了，换成对数值后选取对数期生长率的拐点作为t0，90min后也差不多就是对数末期了，但这种方法因为需要一直测吸光度，所以我的感受态经常污染，而且也没有转化成功。 基本就是这三种方法了，因为我们实验室没有做过枯草的系统，所以很多都是我自己摸索的，比较笨，各位大神不喜勿喷。 我想肯定是有些关键点我没有Get到，一直陷在沼泽之中无法自拔。 望各位大神能倾囊相助，提供一些你们成功的经验，为小女子指点迷津，我将不胜感激！ |
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枯草芽孢杆菌营养递减两步法，一般步骤： 首先，菌体在丰富培养基上生长到对数期末或稳定期初期（可定期检测OD)，转接贫乏培养基，生长至对数期末或稳定期初期（可定期检测OD)，此时感受态效果最好。个人理解，实验环节中，某些protocol的操作参数（例如培养几小时或90min），对于不同的具体培养条件以及不同菌株，具体参数应有所差异，不宜机械照搬。 ps：阴性对照抗性平板上也长，只能说明两点：一、操作有污染，二、抗生素失效了 |
5楼2015-05-10 11:11:25
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