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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 关于构建重组质粒
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焦毅

新虫 (初入文坛)

[交流] 关于构建重组质粒 已有5人参与

我用overlap PCR做出一段1 kb 的片段，片段两端分别设计了BamHI和SacI酶切位点，载体原长6800bp，用BamHI和SacI切掉40bp暴露黏性末端，切完跑胶验证是切断的。用T4连接酶连接到载体上，然后转到大肠杆菌以后一直长不出来。怎样判断是哪一步出了问题？
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1楼 2017-07-22 09:38:47
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江灵敏

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
感受态可能有问题，试试

发自小木虫Android客户端
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2楼2017-07-22 09:49:37
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焦毅

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 江灵敏 at 2017-07-22 09:49:37
感受态可能有问题，试试

感受态没问题，做的对照可以长出来
赞一下 回复此楼
3楼2017-07-22 09:55:43
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
overlap PCR有没有保护碱基？pcr产物是不是也切了？
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4楼2017-07-22 21:14:05
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匿名

用户注销 (著名写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-07-23 09:25:25
本帖仅楼主可见
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5楼2017-07-22 22:21:03
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hubinghello

金虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-07-24 07:48:01
做的酶切位点要有保护碱基，你切片段产物只切掉几十个bp，怎么跑胶确定是切段的啊；
应该是连接这一步的问题，注意连接时载体和片段的摩尔比例，比较重要。
赞一下 回复此楼
去爱吧，像不曾爱过一样；跳舞吧，像没有人观看一样；唱歌吧，像没有人聆听一样；生活吧，像每天都是世界末日一样；赚钱吧，像不是为了钱一样。
6楼2017-07-23 15:35:31
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叶心飞翔

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我觉得可能的原因如下：
1，PCR产物可能酶切没有完全，导致连接效率太低。
2，感受态效率偏低。
祝好！
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7楼2017-07-24 13:02:37
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