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焦毅

新虫 (初入文坛)

[交流] 关于构建重组质粒 已有5人参与

我用overlap PCR做出一段1 kb 的片段,片段两端分别设计了BamHI和SacI酶切位点,载体原长6800bp,用BamHI和SacI切掉40bp暴露黏性末端,切完跑胶验证是切断的。用T4连接酶连接到载体上,然后转到大肠杆菌以后一直长不出来。怎样判断是哪一步出了问题?
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江灵敏

新虫 (小有名气)


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感受态可能有问题,试试

发自小木虫Android客户端
2楼2017-07-22 09:49:37
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焦毅

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 江灵敏 at 2017-07-22 09:49:37
感受态可能有问题,试试

感受态没问题,做的对照可以长出来
3楼2017-07-22 09:55:43
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
overlap PCR有没有保护碱基?pcr产物是不是也切了?
4楼2017-07-22 21:14:05
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匿名

用户注销 (著名写手)

★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-07-23 09:25:25
本帖仅楼主可见
5楼2017-07-22 22:21:03
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hubinghello

金虫 (小有名气)

★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-07-24 07:48:01
做的酶切位点要有保护碱基,你切片段产物只切掉几十个bp,怎么跑胶确定是切段的啊;
应该是连接这一步的问题,注意连接时载体和片段的摩尔比例,比较重要。
去爱吧,像不曾爱过一样;跳舞吧,像没有人观看一样;唱歌吧,像没有人聆听一样;生活吧,像每天都是世界末日一样;赚钱吧,像不是为了钱一样。
6楼2017-07-23 15:35:31
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叶心飞翔

银虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
我觉得可能的原因如下:
1,PCR产物可能酶切没有完全,导致连接效率太低。
2,感受态效率偏低。
祝好!
7楼2017-07-24 13:02:37
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