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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 求助，载体构建一直不成功！我的载体是9k，目的基因1.5k
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时光、过客

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助，载体构建一直不成功！我的载体是9k，目的基因1.5k 已有2人参与

连接转化一直不成功，第一次连接pcr产物连不上，然后就连到T载上，连到T载后双酶切再连接结果还是不成功，阳性转化正常，有一次长了一个单菌落居然是空载！不知道是什么原因！

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1楼 2017-03-23 11:48:29
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时光、过客

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
1楼: Originally posted by 时光、过客 at 2017-03-23 11:48:29
连接转化一直不成功，第一次连接pcr产物连不上，然后就连到T载上，连到T载后双酶切再连接结果还是不成功，阳性转化正常，有一次长了一个单菌落居然是空载！不知道是什么原因！
...

同时问一下，我的载体和目的片段连接时浓度多少比较合适？？

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2楼2017-03-23 11:52:43
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
应该是没连上，你可以适当多加一些片段，载体和片段摩尔比在1:5-1:10应该可以了
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···
3楼2017-03-23 14:50:50
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可以考虑用无缝克隆（我们做了一个无缝克隆试剂盒，效率还不错，比普通酶切连接强多了）。另外，如果你用酶切连接的话，一定要注意载体和片段的浓度，以及回收产物260/280比值在1.8-2.0之间，260/230比值尽量接近于2.0（低于1.2的话就不用做了，至少也要1.5以上做连接才比较好）
good luck
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4楼2017-03-23 20:44:35
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