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时光、过客

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助,载体构建一直不成功!我的载体是9k,目的基因1.5k 已有2人参与

连接转化一直不成功,第一次连接pcr产物连不上,然后就连到T载上,连到T载后双酶切再连接结果还是不成功,阳性转化正常,有一次长了一个单菌落居然是空载!不知道是什么原因!

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时光、过客

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
1楼: Originally posted by 时光、过客 at 2017-03-23 11:48:29
连接转化一直不成功,第一次连接pcr产物连不上,然后就连到T载上,连到T载后双酶切再连接结果还是不成功,阳性转化正常,有一次长了一个单菌落居然是空载!不知道是什么原因!
...

同时问一下,我的载体和目的片段连接时浓度多少比较合适??

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2楼2017-03-23 11:52:43
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
应该是没连上,你可以适当多加一些片段,载体和片段摩尔比在1:5-1:10应该可以了
···
3楼2017-03-23 14:50:50
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
可以考虑用无缝克隆(我们做了一个无缝克隆试剂盒,效率还不错,比普通酶切连接强多了)。另外,如果你用酶切连接的话,一定要注意载体和片段的浓度,以及回收产物260/280比值在1.8-2.0之间,260/230比值尽量接近于2.0(低于1.2的话就不用做了,至少也要1.5以上做连接才比较好)
good luck
4楼2017-03-23 20:44:35
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