应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 用基因组dna扩增长度约为7.8kb的片段，一直扩不出来，求助
71/1返回列表
查看: 2436  |  回复: 6
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

夏夏shadow

新虫 (初入文坛)

[求助] 用基因组dna扩增长度约为7.8kb的片段，一直扩不出来，求助 已有4人参与

用过GC buffer，出现许多非特异性条带，分成两段扩过，后面一段扩出来了，前面的一段扩不出来。由于是要构建载体用的，已经加了酶切识别的引物接头，扩了好多天了，试过两步法：95° 5min，95° 40s，68° 8 min 30循环，72° 10min，25°保存。也试过梯度pcr，将退火温度每一个循环提高0.1度，结果以前有的非特异性条带都没有了，十分干净的没东西。求大神指导
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2015-12-21 10:06:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

uulovelyuu

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1. 你的模板基因组DNA完整性如何？不行重新提取一份，跑个电泳看看然后再扩增。2. 考虑下换个效率更高的扩增酶试试，比如primerstar等。
赞一下 回复此楼
2楼2015-12-21 11:06:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

peptide3986

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

加了接头的话有可能影响结合，试试先扩出来再加接头。
我上次扩3.5Kb的时候是这么干的：
不加接头设计引物，扩出来以后再加接头。
而且，我用基因组DNA当模板，发现没有条带，然后用这个当模板，再扩就出来了。
我用的是primerstar。
赞一下 回复此楼
3楼2016-01-11 17:17:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

草溪河

铁虫 (著名写手)
是长距离酶吗？

发自小木虫Android客户端
回复此楼
4楼2016-01-11 19:53:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

潘潘0227

铜虫 (小有名气)
基因组提取质量如何，如果模版出问题肯定扩不出来。而且片段也太长了，得用特效酶吧，引物是不是得长些？

发自小木虫IOS客户端
赞一下 回复此楼
5楼2016-01-11 21:41:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

原来，是这样

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

试一试takara的LA taq酶，专门扩长片段，退火延伸都是一个温度，不需要你之前那么麻烦。

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
6楼2016-01-11 22:51:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

pengc201

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
7楼2016-01-12 10:31:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 夏夏shadow 的主题更新
71/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.5.5.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +5 l7k6xnh0yc 2026-05-14 5/250 2026-05-16 16:35 by x28q7dxf75
[有机交流] 如何实现卤原子转化 10+3 BT20230424 2026-05-15 5/250 2026-05-16 16:20 by czyzsu
[硕博家园] 考博自荐 +3 科研狗111 2026-05-13 4/200 2026-05-16 11:45 by 科研狗111
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.5.5.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +4 l7k6xnh0yc 2026-05-14 4/200 2026-05-16 11:36 by h3oerqvkv9
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.5.5.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +4 cjf4bx70cj 2026-05-14 6/300 2026-05-16 11:16 by h3oerqvkv9
[考博] 2026博士还有哪些学校有名额 +5 小王求读研 2026-05-15 6/300 2026-05-16 10:44 by a4742549
[基金申请] 这年头没有找到涵评专家，还有中面上的可能吗 +11 dd921ww 2026-05-12 13/650 2026-05-16 09:16 by Howard28
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.5.5.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +4 l7k6xnh0yc 2026-05-14 5/250 2026-05-16 04:29 by k37jurhrau
[文学芳草园] 窗边初夏的小雨 +8 阿美_Lml888 2026-05-09 11/550 2026-05-15 23:54 by WASM
[文学芳草园] 风把牡丹吹跑了 +5 myrtle 2026-05-12 9/450 2026-05-15 15:27 by myrtle
[基金申请] 青C资助名额大幅增加！ +11 西葫芦炒鸡蛋 2026-05-13 15/750 2026-05-15 14:36 by ambravo
[基金申请] 精华III:  评审感受-评审感受-评审感受 +14 ferrarichen 2026-05-11 18/900 2026-05-15 11:12 by cmhchen
[教师之家] 教学课件你会给同学吗 +8 硕士研究生吗 2026-05-13 8/400 2026-05-14 22:23 by 常规沥青
[考博] 26应届毕业生考博求助 +3 wo一定上岸 2026-05-13 3/150 2026-05-14 21:47 by 明海天涯
[基金申请] 重磅！青年科学基金项目（C类）资助增幅预计超过50% +5 水和泥不是水泥 2026-05-13 7/350 2026-05-14 20:57 by 水和泥不是水泥
[有机交流] 求助2，4-二氯-5-嘧啶甲醛的合成方法 20+3 光吃不拉 2026-05-14 5/250 2026-05-14 20:15 by 一切都是空工
[高分子] 本人最近太闲了，谁有问题可以提，每天会统一回复 +8 一切都是空工 2026-05-12 19/950 2026-05-14 20:03 by 一切都是空工
[考博] 材料类只有一篇综述能申博么 +4 乐逍遥谷 2026-05-13 4/200 2026-05-14 12:05 by zhyzzh
[论文投稿] 求助大佬sci投稿哪个好中 +3 江沅188 2026-05-12 4/200 2026-05-13 14:35 by 江沅188
[考博] 现在不知道怎么办，感觉很痛苦 +4 qweww 2026-05-11 5/250 2026-05-11 20:23 by Oversize
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭