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夏夏shadow

新虫 (初入文坛)

[求助] 用基因组dna扩增长度约为7.8kb的片段,一直扩不出来,求助 已有4人参与

用过GC buffer,出现许多非特异性条带,分成两段扩过,后面一段扩出来了,前面的一段扩不出来。由于是要构建载体用的,已经加了酶切识别的引物接头,扩了好多天了,试过两步法:95° 5min,95° 40s,68° 8 min 30循环,72° 10min,25°保存。也试过梯度pcr,将退火温度每一个循环提高0.1度,结果以前有的非特异性条带都没有了,十分干净的没东西。求大神指导
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uulovelyuu

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
1. 你的模板基因组DNA完整性如何?不行重新提取一份,跑个电泳看看然后再扩增。2. 考虑下换个效率更高的扩增酶试试,比如primerstar等。
2楼2015-12-21 11:06:40
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peptide3986

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

加了接头的话有可能影响结合,试试先扩出来再加接头。
我上次扩3.5Kb的时候是这么干的:
不加接头设计引物,扩出来以后再加接头。
而且,我用基因组DNA当模板,发现没有条带,然后用这个当模板,再扩就出来了。
我用的是primerstar。
3楼2016-01-11 17:17:41
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草溪河

铁虫 (著名写手)

4楼2016-01-11 19:53:00
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潘潘0227

铜虫 (小有名气)

基因组提取质量如何,如果模版出问题肯定扩不出来。而且片段也太长了,得用特效酶吧,引物是不是得长些?

发自小木虫IOS客户端
5楼2016-01-11 21:41:12
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原来,是这样

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

试一试takara的LA taq酶,专门扩长片段,退火延伸都是一个温度,不需要你之前那么麻烦。

发自小木虫Android客户端
6楼2016-01-11 22:51:02
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pengc201

禁虫 (小有名气)

本帖内容被屏蔽

7楼2016-01-12 10:31:56
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