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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 用基因组dna扩增长度约为7.8kb的片段，一直扩不出来，求助
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夏夏shadow

新虫 (初入文坛)

[求助] 用基因组dna扩增长度约为7.8kb的片段，一直扩不出来，求助 已有4人参与

用过GC buffer，出现许多非特异性条带，分成两段扩过，后面一段扩出来了，前面的一段扩不出来。由于是要构建载体用的，已经加了酶切识别的引物接头，扩了好多天了，试过两步法：95° 5min，95° 40s，68° 8 min 30循环，72° 10min，25°保存。也试过梯度pcr，将退火温度每一个循环提高0.1度，结果以前有的非特异性条带都没有了，十分干净的没东西。求大神指导
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1楼 2015-12-21 10:06:29
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uulovelyuu

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1. 你的模板基因组DNA完整性如何？不行重新提取一份，跑个电泳看看然后再扩增。2. 考虑下换个效率更高的扩增酶试试，比如primerstar等。
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2楼2015-12-21 11:06:40
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peptide3986

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

加了接头的话有可能影响结合，试试先扩出来再加接头。
我上次扩3.5Kb的时候是这么干的：
不加接头设计引物，扩出来以后再加接头。
而且，我用基因组DNA当模板，发现没有条带，然后用这个当模板，再扩就出来了。
我用的是primerstar。
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3楼2016-01-11 17:17:41
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草溪河

铁虫 (著名写手)
是长距离酶吗？

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4楼2016-01-11 19:53:00
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潘潘0227

铜虫 (小有名气)
基因组提取质量如何，如果模版出问题肯定扩不出来。而且片段也太长了，得用特效酶吧，引物是不是得长些？

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5楼2016-01-11 21:41:12
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原来，是这样

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

试一试takara的LA taq酶，专门扩长片段，退火延伸都是一个温度，不需要你之前那么麻烦。

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6楼2016-01-11 22:51:02
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pengc201

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
7楼2016-01-12 10:31:56
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