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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 蛋白挂不上柱子
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一粒儿糖

新虫 (小有名气)

[求助] 蛋白挂不上柱子 已有6人参与

求大神指点，蛋白纯化了一个月了，还是没有出来，蛋白是多聚体，表达在上清里，表达量还可以，蛋白等电点4.7上下，镍柱挂不上，q柱和Sp柱，疏水柱也挂不上，q柱流穿里有，但是量少，硫酸铵沉淀是复溶后上清里量也很少
Q柱2
缓冲液Tris-HCl
Ph：8.0   20mM  Tris-HCl
电导：1.53
蛋白：
Ph：8.0   20mM Tris-HCl
电导：1.3


sp柱
缓冲液PB
Ph：6.56  20mM PB
电导：1.89
蛋白
Ph：6.56  
电导：1.57
1ml蛋白+4ml H2O
洗脱：500mMNaCL+20mMPB
1MNaCL+20mMPB
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平凡。。。。
1楼 2017-03-23 10:19:45
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回帖置顶 ( 共有1个 )

hc-material

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

镍柱缓冲液体系中加4-8M的尿素试试，Q柱层析时，减慢上样流速。减少上样量。
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12楼2017-08-08 10:58:57
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普通回帖

liaohongjun

铁虫 (小有名气)
Q柱，降低上样流速！检查样品pH,电导是否与平衡缓冲液一致！SP柱平衡缓冲液pH都已经高于目标蛋白等电点了！肯定挂不上去！

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2楼2017-03-23 11:47:36
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fexcths

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
“表达在上清里，表达量还可以”从这句我大概判断出你这是工程菌表达的。那么请确认你的的载体蛋白，因为NI柱是纯化含有HIS标签的蛋白的。 如果是含HIS标签的蛋白，那么你挂不上ni柱可能是有两点：一是buffer，这需要你多多尝试，二是柱效不行了，这就需要你做一下再生了
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3楼2017-03-24 09:23:35
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fexcths

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

链接: https://pan.baidu.com/s/1qY0Mpoo 密码: what 希望对你有用。
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4楼2017-03-24 09:42:34
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hc-material

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
问题太笼统，问题是啥，上样速度，平衡柱子，上样等等。多大柱子
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5楼2017-03-24 11:26:01
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yxncas-2012

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你得看看是不是带标签，才去挂镍柱啊。最好把你的电泳图贴一个看看，分子大小？多聚体是几聚，其等电点可能不是理论那个值了
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6楼2017-03-24 13:01:29
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chen_b_hua

新虫 (初入文坛)
换下填料试试
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7楼2017-04-22 18:17:39
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张木0000

木虫 (正式写手)
只知道你的

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8楼2017-05-10 21:53:43
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张木0000

木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 张木0000 at 2017-05-10 21:53:43
只知道你的

只知道你的SP是有问题，想要挂上强阳离子交换，蛋白要带正电啊～

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9楼2017-05-10 21:55:58
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张木0000

木虫 (正式写手)
疏水层析挂不上可能是你的硫酸铵浓度不够～

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10楼2017-05-10 21:59:27
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