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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求助：PCR扩增不出条带
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labglion

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助：PCR扩增不出条带 已有3人参与

本人新手，最近在扩增RNA病毒中的两段基因分别为VP1和3D，提取的RNA用通用引物反转录得到cDNA，用检测引物可以看出条带很亮，但用扩增基因全长的引物就扩不出来了，反转录引物是用的Oligo dT，也尝试过自己设计的下游引物，PCR引物试了好多，酶也换过几种，退火温度梯度做过50-60度的，DMSO也试过，本来觉得很简单的一点实验一直卡在这不动了，自己都快没有信心了。求大神们不吝赐教。

求助：PCR扩增不出条带
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1楼 2017-02-28 17:31:26
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

xinxiyuzhou

至尊木虫 (著名写手)
试试在前后各设计一对引物看是否可以扩出来。

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5楼2017-03-04 16:44:44
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labglion

新虫 (初入文坛)
自己顶顶，没有大神来帮忙么？ 想问一下除了引物问题，会不会有可能是RNA在提取过程断裂了呢？检测引物扩增片段长度为358bp，而我想扩增的两段基因长度分别为762bp和1407bp，有没有这个可能呢？
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2楼2017-03-04 15:51:48
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xinxiyuzhou

至尊木虫 (著名写手)
检测引物是什么鬼？这么短的片段应该很容易扩出来的，是在做不出来可以用融合PCR，找找相关的文献，直接拿别人的条件应该可以做的出来

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3楼2017-03-04 16:15:37
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labglion

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by xinxiyuzhou at 2017-03-04 16:15:37
检测引物是什么鬼？这么短的片段应该很容易扩出来的，是在做不出来可以用融合PCR，找找相关的文献，直接拿别人的条件应该可以做的出来

检测引物是我在拿到病料之后用来检测是否含有这种病毒的引物。相关文献找过，用了不少别人的引物也是扩不出来。
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4楼2017-03-04 16:41:58
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

不知道楼主问题解决没？我也遇到相同的情况，前中后三个位置分别设计了引物，中间一段跨越内含子，片段200bp左右，都可以p的出来，但是全长就是p不出来，现在正在从基因组上进行两段pcr，之后连接~
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···
6楼2017-03-09 08:56:11
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labglion

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by xinxiyuzhou at 2017-03-04 16:44:44
试试在前后各设计一对引物看是否可以扩出来。

这几天尝试过你说的这种方法，还是没有扩增出来。我怀疑不是引物的问题，因为真的已经尝试过了对很多引物了，有自己设计的，也有文献上的。这么多引物，总该有合适的吧？
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7楼2017-03-09 15:43:44
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labglion

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 小冀- at 2017-03-09 08:56:11
不知道楼主问题解决没？我也遇到相同的情况，前中后三个位置分别设计了引物，中间一段跨越内含子，片段200bp左右，都可以p的出来，但是全长就是p不出来，现在正在从基因组上进行两段pcr，之后连接~

问题还没有解决，依旧是扩不出来。我做的是病毒，按说应该更简单一些，快失去信心了
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8楼2017-03-09 15:45:11
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
引用回帖:
8楼: Originally posted by labglion at 2017-03-09 15:45:11
问题还没有解决，依旧是扩不出来。我做的是病毒，按说应该更简单一些，快失去信心了...

彼此彼此，一起加油吧，祝好
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···
9楼2017-03-09 16:03:56
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中洪小刘

新虫 (小有名气)
您好，有考虑过专业的生物公司提供帮助吗，我这边希望能帮到您！

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10楼2017-03-09 17:25:40
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