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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 专业学科区 » 农林 » 水产 » PCR扩增条带不清晰的一点问题
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天蓝鱼儿会飞

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR扩增条带不清晰的一点问题已有1人参与

上一周提的斑马鱼RNA，当时浓度非常好，直接反转录得到了cDNA模版，之后引物扩增，有较清晰的目的条带，再次跑了5管，但是不太清晰了，切胶回收，连接转化然后摇菌，菌长的不多，检测的时候就没有了，只有二聚体。再次调整体系，循环数由35减到了30，效果不好。我想问问各位：
1. cDNA模版一般要稀释多少倍？我直接用的原液是不是有点浓？
2. PCR的体系怎么摸索能使条带清晰？
3.菌的多少是不是跟模版浓度有关？
4.还有好的建议我很愿意采纳！
图就不放了， 都是二聚体
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海上巨鳄正在登陆！
1楼2017-02-26 15:09:41
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海里的螺

新虫 (初入文坛)
可以用第一次跑的PCR产物做模板再跑一次，这样产物就增加了

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3楼2017-03-24 23:18:34
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18347265620

新虫 (初入文坛)
cDNA直接用浓度太高了，至少稀释100倍，有引物二聚体就在提高退火温度试试

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2楼2017-03-17 15:06:51
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longguigen

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

你切胶回收后有没有再次检测？建议回收后再跑胶检测，
连接后尽量尽快做转化，不要等
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4楼2017-03-28 22:51:06
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Wq风君子

新虫 (初入文坛)
请问有没有遇到过提不出RNA的情况，是鱼的问题吗

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5楼2020-07-29 15:52:23
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