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天蓝鱼儿会飞

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR扩增条带不清晰的一点问题 已有1人参与

上一周提的斑马鱼RNA,当时浓度非常好,直接反转录得到了cDNA模版,之后引物扩增,有较清晰的目的条带,再次跑了5管,但是不太清晰了,切胶回收,连接转化然后摇菌,菌长的不多,检测的时候就没有了,只有二聚体。再次调整体系,循环数由35减到了30,效果不好。我想问问各位:
1. cDNA模版一般要稀释多少倍?我直接用的原液是不是有点浓?
2. PCR的体系怎么摸索能使条带清晰?
3.菌的多少是不是跟模版浓度有关?
4.还有好的建议我很愿意采纳!
图就不放了, 都是二聚体
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海上巨鳄正在登陆!
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18347265620

新虫 (初入文坛)

cDNA直接用浓度太高了,至少稀释100倍,有引物二聚体就在提高退火温度试试

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2楼2017-03-17 15:06:51
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海里的螺

新虫 (初入文坛)

可以用第一次跑的PCR产物做模板再跑一次,这样产物就增加了

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3楼2017-03-24 23:18:34
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longguigen

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

你切胶回收后有没有再次检测?建议回收后再跑胶检测,
连接后尽量尽快做转化,不要等
4楼2017-03-28 22:51:06
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Wq风君子

新虫 (初入文坛)

请问有没有遇到过提不出RNA的情况,是鱼的问题吗

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5楼2020-07-29 15:52:23
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splendid-赟

新虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by Wq风君子 at 2020-07-29 15:52:23
请问有没有遇到过提不出RNA的情况,是鱼的问题吗

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6楼2020-08-01 17:07:13
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