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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 一对引物扩增，出现两条带
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安群星

新虫 (初入文坛)

[求助] 一对引物扩增，出现两条带 已有5人参与

大家好，小弟最近碰到问题，请大家帮帮忙解决一下。情况是这样的，我用的是Takara的一个载体，在载体上连接了我的目的片段1200bp左右。转化后，用该载体的通用引物扩增，出现了两条带，一条1200bp左右（可能就是我的目的带），一条3000bp左右，且这两条带都很暗。同时，我又用我目的片段的引物扩增，只出现大小相符的目的带。送去测序，引物为目的基因引物时，测序结果与我的目的基因序列相符，证明目的基因是插进去了；但当我用载体的通用引物测序时，就测不出来了。我也尝试胶回收3000bp处的条带链接T载体测序，但由于条带很暗，胶回收后浓度很低，与T载体链接没有成功。请各位大侠帮我分析下。不甚感激
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1楼 2016-11-28 13:50:56
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安群星

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 浮笙若梦 at 2016-12-26 15:35:13
是不是你连在T载体之后酶切没有完全或者上面有两个同样的酶切位点。

我看了一下，T载体本身是带有我选的这两个酶切位点的，我在扩增我的目的片段的时候在引物的两端又引入的酶切位点，这样的话，构建的T载体的确是有两个相同的酶切位点。但也不应该出现这么诡异的现象啊。ps：非常感谢您的回答
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8楼2016-12-29 11:42:12
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winyuyuyu123

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2016-12-02 21:28:17
污染了，挑菌时挑的不是单菌落，或者转化时一个菌里边转进去两个质粒。
出现你那种现象的原因：
通用引物会同时结合两个载体，因此你扩增会出现两条带，测序的话也会出现杂峰导致测不出来。
用你自己的引物只结合你的目标载体，所以只能扩增一条带，测序也能正常测出。
解决方案：
1：现有菌液稀释涂板或平板划线，重新挑取单菌落摇菌培养。
2：若上述方法无法解决，可能是转入多个质粒，重做连接或吧之前做转化的平板拿来重新挑单菌落检测。
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2楼2016-11-29 09:05:31
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安群星

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by winyuyuyu123 at 2016-11-29 09:05:31
污染了，挑菌时挑的不是单菌落，或者转化时一个菌里边转进去两个质粒。
出现你那种现象的原因：
通用引物会同时结合两个载体，因此你扩增会出现两条带，测序的话也会出现杂峰导致测不出来。
用你自己的引物只结合 ...

首先，非常感谢您的回答。
我后面又新提空载质粒，拿载体的通用引物去扩增，也是扩增出两条带。一条是300bp左右（这个跟空载序列信息符合），一条是进1500bp条带（这条不知道怎么来的），不知道是怎么回事。引物是新用的一管引物，不会有污染。引物是按载体说明书上标注的测序引物序列合成，照理说应该不会特异性不好吧？
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3楼2016-12-01 11:50:13
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Alice 2016

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

会不会是你的引物不特异，把载体上面的片段扩出来了呀，你可以把你的引物拿去NCBI上blast一下
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怕什么真理无穷，进一寸有一寸的欢喜
4楼2016-12-02 16:51:45
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