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测序结果少了500bp可是PCR结果完全正确
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各位高手，我是新手，请大家不吝赐教。 我半年前克隆了一个大片段基因簇 （大概有80KB）到BAC里面，然后想做异源表达，可是发现不了目标产物，因此怀疑是基因簇在克隆时出现错误。所以我就把这个质粒提取出来交给商业机构测序，结果出来以后，我用NCBI去对比测序结果和真实的基因簇序列，结果显示：除了基因簇中间的一个重要功能基因缺失了500 bp 以外，其余的结果都是100% 的 identity. 然后我深深地怀疑这个结果，总感觉不太可能，所以我就设计了一对PCR引物，用来扩增这些缺失的碱基，结果PCR是阳性的，为了进一步确认，我又把这个PCR的产物提纯测序，结果正是缺失的那500 bp. 对了忘了说明，基因簇的测序结果就是从缺失部分地两端开始读取和结束的，会不会是这个原因呢？菜鸟一个，说的不明白请谅解，如果各位达人有什么疑问，我可以补充，快要被这个问题烦死了。下面画了一个草图，新手金币不多，万分感谢。  Picture1.jpg |
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7楼2016-01-04 07:57:28
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建议换个机构再测试一次，测试的是能够覆盖500bp的新的PCR片段，你前后多加个1000bp足够了吧。 另外，我还真是没有见过插入80kb的片段的质粒，什么质粒，可以插入那么大片段。 发自小木虫Android客户端 |
8楼2016-01-04 08:14:59
9楼2016-01-04 10:58:58