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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物信息 » 测序结果少了500bp可是PCR结果完全正确
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n_drifter

新虫 (小有名气)

[求助] 测序结果少了500bp可是PCR结果完全正确

各位高手，我是新手，请大家不吝赐教。

我半年前克隆了一个大片段基因簇 （大概有80KB）到BAC里面，然后想做异源表达，可是发现不了目标产物，因此怀疑是基因簇在克隆时出现错误。所以我就把这个质粒提取出来交给商业机构测序，结果出来以后，我用NCBI去对比测序结果和真实的基因簇序列，结果显示：除了基因簇中间的一个重要功能基因缺失了500 bp 以外，其余的结果都是100% 的 identity. 然后我深深地怀疑这个结果，总感觉不太可能，所以我就设计了一对PCR引物，用来扩增这些缺失的碱基，结果PCR是阳性的，为了进一步确认，我又把这个PCR的产物提纯测序，结果正是缺失的那500 bp.

对了忘了说明，基因簇的测序结果就是从缺失部分地两端开始读取和结束的，会不会是这个原因呢？菜鸟一个，说的不明白请谅解，如果各位达人有什么疑问，我可以补充，快要被这个问题烦死了。下面画了一个草图，新手金币不多，万分感谢。

测序结果少了500bp可是PCR结果完全正确
Picture1.jpg
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1楼 2016-01-04 06:09:41
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丝竹睛明

新虫 (小有名气)
80kb少500bp是怎么判断pcr正确的？看不出来吧应该！

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2楼2016-01-04 07:14:08
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n_drifter

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 丝竹睛明 at 2016-01-04 07:14:08
80kb少500bp是怎么判断pcr正确的？看不出来吧应该！

谢谢您的回复，我就是用NCBI的nucleotide blast对比的啊，一点一点的找，最后发现了500 bp的缺失

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3楼2016-01-04 07:18:13
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丝竹睛明

新虫 (小有名气)
你p的是已经建好的质粒么？

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4楼2016-01-04 07:21:27
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n_drifter

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 丝竹睛明 at 2016-01-04 07:21:27
你p的是已经建好的质粒么？

是的，不好意思忘了说了

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5楼2016-01-04 07:27:12
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丝竹睛明

新虫 (小有名气)
这样的话就是测序或他们拼接问题了，你的没目的产物？那得从表达方面找问题了，还有是高保真酶扩的么？

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6楼2016-01-04 07:34:01
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n_drifter

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 丝竹睛明 at 2016-01-04 07:34:01
这样的话就是测序或他们拼接问题了，你的没目的产物？那得从表达方面找问题了，还有是高保真酶扩的么？

不是高保真，但PCR产物也测序了，没问题。您说的对，我下一步准备往里面塞强启动子，但是想先百分百确定基因簇没有问题

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7楼2016-01-04 07:57:28
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生命之谜

新虫 (小有名气)
建议换个机构再测试一次，测试的是能够覆盖500bp的新的PCR片段，你前后多加个1000bp足够了吧。
另外，我还真是没有见过插入80kb的片段的质粒，什么质粒，可以插入那么大片段。

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8楼2016-01-04 08:14:59
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丝竹睛明

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by n_drifter at 2016-01-04 07:57:28
不是高保真，但PCR产物也测序了，没问题。您说的对，我下一步准备往里面塞强启动子，但是想先百分百确定基因簇没有问题
...

真核表达的话，试试cmv

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9楼2016-01-04 10:58:58
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