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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 一对引物扩增，出现两条带
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安群星

新虫 (初入文坛)

[求助] 一对引物扩增，出现两条带已有5人参与

大家好，小弟最近碰到问题，请大家帮帮忙解决一下。情况是这样的，我用的是Takara的一个载体，在载体上连接了我的目的片段1200bp左右。转化后，用该载体的通用引物扩增，出现了两条带，一条1200bp左右（可能就是我的目的带），一条3000bp左右，且这两条带都很暗。同时，我又用我目的片段的引物扩增，只出现大小相符的目的带。送去测序，引物为目的基因引物时，测序结果与我的目的基因序列相符，证明目的基因是插进去了；但当我用载体的通用引物测序时，就测不出来了。我也尝试胶回收3000bp处的条带链接T载体测序，但由于条带很暗，胶回收后浓度很低，与T载体链接没有成功。请各位大侠帮我分析下。不甚感激
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1楼2016-11-28 13:50:56
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winyuyuyu123

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2016-12-02 21:28:17
污染了，挑菌时挑的不是单菌落，或者转化时一个菌里边转进去两个质粒。
出现你那种现象的原因：
通用引物会同时结合两个载体，因此你扩增会出现两条带，测序的话也会出现杂峰导致测不出来。
用你自己的引物只结合你的目标载体，所以只能扩增一条带，测序也能正常测出。
解决方案：
1：现有菌液稀释涂板或平板划线，重新挑取单菌落摇菌培养。
2：若上述方法无法解决，可能是转入多个质粒，重做连接或吧之前做转化的平板拿来重新挑单菌落检测。
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2楼2016-11-29 09:05:31
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安群星

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by winyuyuyu123 at 2016-11-29 09:05:31
污染了，挑菌时挑的不是单菌落，或者转化时一个菌里边转进去两个质粒。
出现你那种现象的原因：
通用引物会同时结合两个载体，因此你扩增会出现两条带，测序的话也会出现杂峰导致测不出来。
用你自己的引物只结合 ...

首先，非常感谢您的回答。
我后面又新提空载质粒，拿载体的通用引物去扩增，也是扩增出两条带。一条是300bp左右（这个跟空载序列信息符合），一条是进1500bp条带（这条不知道怎么来的），不知道是怎么回事。引物是新用的一管引物，不会有污染。引物是按载体说明书上标注的测序引物序列合成，照理说应该不会特异性不好吧？
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3楼2016-12-01 11:50:13
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Alice 2016

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

会不会是你的引物不特异，把载体上面的片段扩出来了呀，你可以把你的引物拿去NCBI上blast一下
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怕什么真理无穷，进一寸有一寸的欢喜
4楼2016-12-02 16:51:45
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安群星

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by Alice 2016 at 2016-12-02 16:51:45
会不会是你的引物不特异，把载体上面的片段扩出来了呀，你可以把你的引物拿去NCBI上blast一下

我将3000bp大小的产物拿去测序了，里面有我的目的片段，但是目的片段两边有T载的片段，可能正是由于这个原因造成了那个3000bp的产物，不知道为什么这个T载上的片段怎么会脸上表达载体上，现在更迷惑了，如果我的目的片段在3000bp的产物中，那1500bp大小的片段又是什么呢？
注：我是现将目的片段连在T载上，再从这个载体上双酶切连在表达载体上的
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5楼2016-12-26 14:40:43
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
你的通用引物和载体全部序列Blast一下，显然有两个结合位点，不然空载不应该出两条带，排除空载体两条带的问题，你后续的实验才能解决。不过你测序的结果（3000多的）如果能比对到完整的序列，且插入位点正确，那么我基本可以判断，酶切连接成功，换通用引物，之前的问题就不存在了。        另外，楼上说同一个菌转入多个质粒，就必须重新连接，其实可以提质粒重新转化，挑单克隆。

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6楼2016-12-26 15:22:09
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浮笙若梦

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

是不是你连在T载体之后酶切没有完全或者上面有两个同样的酶切位点。
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7楼2016-12-26 15:35:13
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安群星

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 浮笙若梦 at 2016-12-26 15:35:13
是不是你连在T载体之后酶切没有完全或者上面有两个同样的酶切位点。

我看了一下，T载体本身是带有我选的这两个酶切位点的，我在扩增我的目的片段的时候在引物的两端又引入的酶切位点，这样的话，构建的T载体的确是有两个相同的酶切位点。但也不应该出现这么诡异的现象啊。ps：非常感谢您的回答
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8楼2016-12-29 11:42:12
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安群星

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by yujiaping1 at 2016-12-26 15:22:09
你的通用引物和载体全部序列Blast一下，显然有两个结合位点，不然空载不应该出两条带，排除空载体两条带的问题，你后续的实验才能解决。不过你测序的结果（3000多的）如果能比对到完整的序列，且插入位点正确，那么 ...

非常感谢您的回答。
可能我的表述不是很清楚。是这样的，我有一段目的片段，用两端带有酶切位点的引物扩增，然后将PCR产物连接入T载体。这时测序是拿的我扩增的引物测序的（那时候觉得用扩增引物测序也是可以的），测序结果表明有我的目的条带，序列正确。然后，我开始表达载体的构建，双酶切构建的T载质粒，回收大小符合的目的片段，与经双酶切的表达载体做连接转化，挑取了两株阳性克隆（这是用菌落PCR鉴定的，用的引物也是目的片段的引物），这时，诡异的出现了，若用目的片段扩增引物扩增阳性转化子质粒，出现一条带（条带很明显），若用表达载体的通用引物去扩增，则出现两条带（一条3000bp左右，一条1500bp左右，我的目的条带大小是1100bp左右，通用引物中间序列300bp左右），拿转化子质粒测序，通用引物测不出来，目的片段扩增引物能测出来。就是这样的，不知道哪里出现问题。望大家帮忙想想办法，非常感谢。
构建了不止两次，只有两次构建长出了阳性克隆，挑出的转化子都是这种情况。
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9楼2016-12-29 11:54:03
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安群星

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by winyuyuyu123 at 2016-11-29 09:05:31
污染了，挑菌时挑的不是单菌落，或者转化时一个菌里边转进去两个质粒。
出现你那种现象的原因：
通用引物会同时结合两个载体，因此你扩增会出现两条带，测序的话也会出现杂峰导致测不出来。
用你自己的引物只结合 ...

当时挑了两株阳性转化子，都是出现的这种情况，感觉不像是污染，要不然不能刚好都污染了吧，非常谢谢你。
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10楼2016-12-29 11:55:46
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