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一对引物扩增，出现两条带 已有5人参与
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| 大家好，小弟最近碰到问题，请大家帮帮忙解决一下。情况是这样的，我用的是Takara的一个载体，在载体上连接了我的目的片段1200bp左右。转化后，用该载体的通用引物扩增，出现了两条带，一条1200bp左右（可能就是我的目的带），一条3000bp左右，且这两条带都很暗。同时，我又用我目的片段的引物扩增，只出现大小相符的目的带。送去测序，引物为目的基因引物时，测序结果与我的目的基因序列相符，证明目的基因是插进去了；但当我用载体的通用引物测序时，就测不出来了。我也尝试胶回收3000bp处的条带链接T载体测序，但由于条带很暗，胶回收后浓度很低，与T载体链接没有成功。请各位大侠帮我分析下。不甚感激 |
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winyuyuyu123
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Alice 2016
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你的通用引物和载体全部序列Blast一下，显然有两个结合位点，不然空载不应该出两条带，排除空载体两条带的问题，你后续的实验才能解决。不过你测序的结果（3000多的）如果能比对到完整的序列，且插入位点正确，那么我基本可以判断，酶切连接成功，换通用引物，之前的问题就不存在了。 另外，楼上说同一个菌转入多个质粒，就必须重新连接，其实可以提质粒重新转化，挑单克隆。 发自小木虫IOS客户端 |
6楼2016-12-26 15:22:09
7楼2016-12-26 15:35:13
8楼2016-12-29 11:42:12
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非常感谢您的回答。 可能我的表述不是很清楚。是这样的，我有一段目的片段，用两端带有酶切位点的引物扩增，然后将PCR产物连接入T载体。这时测序是拿的我扩增的引物测序的（那时候觉得用扩增引物测序也是可以的），测序结果表明有我的目的条带，序列正确。然后，我开始表达载体的构建，双酶切构建的T载质粒，回收大小符合的目的片段，与经双酶切的表达载体做连接转化，挑取了两株阳性克隆（这是用菌落PCR鉴定的，用的引物也是目的片段的引物），这时，诡异的出现了，若用目的片段扩增引物扩增阳性转化子质粒，出现一条带（条带很明显），若用表达载体的通用引物去扩增，则出现两条带（一条3000bp左右，一条1500bp左右，我的目的条带大小是1100bp左右，通用引物中间序列300bp左右），拿转化子质粒测序，通用引物测不出来，目的片段扩增引物能测出来。就是这样的，不知道哪里出现问题。望大家帮忙想想办法，非常感谢。 构建了不止两次，只有两次构建长出了阳性克隆，挑出的转化子都是这种情况。 |
9楼2016-12-29 11:54:03
10楼2016-12-29 11:55:46
