24小时热门版块排行榜    

查看: 11408  |  回复: 12
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

安群星

新虫 (初入文坛)

[求助] 一对引物扩增,出现两条带 已有5人参与

大家好,小弟最近碰到问题,请大家帮帮忙解决一下。情况是这样的,我用的是Takara的一个载体,在载体上连接了我的目的片段1200bp左右。转化后,用该载体的通用引物扩增,出现了两条带,一条1200bp左右(可能就是我的目的带),一条3000bp左右,且这两条带都很暗。同时,我又用我目的片段的引物扩增,只出现大小相符的目的带。送去测序,引物为目的基因引物时,测序结果与我的目的基因序列相符,证明目的基因是插进去了;但当我用载体的通用引物测序时,就测不出来了。我也尝试胶回收3000bp处的条带链接T载体测序,但由于条带很暗,胶回收后浓度很低,与T载体链接没有成功。请各位大侠帮我分析下。不甚感激
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

安群星

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by winyuyuyu123 at 2016-11-29 09:05:31
污染了,挑菌时挑的不是单菌落,或者转化时一个菌里边转进去两个质粒。
出现你那种现象的原因:
通用引物会同时结合两个载体,因此你扩增会出现两条带,测序的话也会出现杂峰导致测不出来。
用你自己的引物只结合 ...

首先,非常感谢您的回答。
我后面又新提空载质粒,拿载体的通用引物去扩增,也是扩增出两条带。一条是300bp左右(这个跟空载序列信息符合),一条是进1500bp条带(这条不知道怎么来的),不知道是怎么回事。引物是新用的一管引物,不会有污染。引物是按载体说明书上标注的测序引物序列合成,照理说应该不会特异性不好吧?
3楼2016-12-01 11:50:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 13 个回答

winyuyuyu123

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2016-12-02 21:28:17
污染了,挑菌时挑的不是单菌落,或者转化时一个菌里边转进去两个质粒。
出现你那种现象的原因:
通用引物会同时结合两个载体,因此你扩增会出现两条带,测序的话也会出现杂峰导致测不出来。
用你自己的引物只结合你的目标载体,所以只能扩增一条带,测序也能正常测出。
解决方案:
1:现有菌液稀释涂板或平板划线,重新挑取单菌落摇菌培养。
2:若上述方法无法解决,可能是转入多个质粒,重做连接或吧之前做转化的平板拿来重新挑单菌落检测。
2楼2016-11-29 09:05:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Alice 2016

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

会不会是你的引物不特异,把载体上面的片段扩出来了呀,你可以把你的引物拿去NCBI上blast一下
怕什么真理无穷,进一寸有一寸的欢喜
4楼2016-12-02 16:51:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

安群星

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by Alice 2016 at 2016-12-02 16:51:45
会不会是你的引物不特异,把载体上面的片段扩出来了呀,你可以把你的引物拿去NCBI上blast一下

我将3000bp大小的产物拿去测序了,里面有我的目的片段,但是目的片段两边有T载的片段,可能正是由于这个原因造成了那个3000bp的产物,不知道为什么这个T载上的片段怎么会脸上表达载体上,现在更迷惑了,如果我的目的片段在3000bp的产物中,那1500bp大小的片段又是什么呢?
注:我是现将目的片段连在T载上,再从这个载体上双酶切连在表达载体上的
5楼2016-12-26 14:40:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 面上合作单位盖章 +6 ssyjh 2026-08-27 9/450 2026-09-01 20:01 by huagongfeihu
[基金申请] 为什么国自然不能直接公布 +5 bjdxyxy 2026-08-26 5/250 2026-09-01 17:54 by 小伟大博士
[基金申请] 为什么资助数各大高校都创新高,自己申请怎么就这么难 +13 Kittylucky 2026-08-27 14/700 2026-09-01 11:06 by feng6531
[论文投稿] 小白求助 投论文要求的highlights应该如何写 5+3 l1963982152 2026-08-29 4/200 2026-09-01 09:04 by 北京莱茵编辑
[基金申请] 国社科又开始会评了,不知道这次命运如何 +7 雨打竹帘 2026-08-30 11/550 2026-08-31 23:16 by hittle2008
[基金申请] 哪位高人中了,把查询到的截图贴出来让我看看,让我长长见识 +6 yuleib84 2026-08-26 7/350 2026-08-31 19:46 by 鱼翔浅底1
[基金申请] 能否申诉? +7 echo8914667 2026-08-30 8/400 2026-08-31 17:00 by yihongxu
[基金申请] 中青基了要发朋友圈吗? +7 349506619 2026-08-28 7/350 2026-08-31 13:39 by 冼亮淀粉酶
[基金申请] 有没有仍没收到信息的 +7 德尚中行 2026-08-27 8/400 2026-08-30 20:52 by purplejack
[基金申请] 我就是申请一个面上项目而已,这评审意见是按照杰青的条件评的吧? +6 gouxfjh 2026-08-28 11/550 2026-08-30 07:57 by gouxfjh
[基金申请] 国自然评审意见 +13 wangmingqi 2026-08-28 19/950 2026-08-29 10:22 by Poppy1104
[基金申请] 2026年叶企孙基金 +4 bud_bud 2026-08-27 7/350 2026-08-29 07:23 by foolishmani
[基金申请] 系统查不到 +11 董八千 2026-08-26 11/550 2026-08-28 18:06 by Leogzhya
[基金申请] 怎么查啊 +6 huang1991js 2026-08-26 6/300 2026-08-28 08:42 by winsaint
[基金申请] 看板上这么多中的,有点像50人群里49个人都是骗子的那种感觉…… +5 a089 2026-08-26 6/300 2026-08-27 14:05 by jonewore
[基金申请] 国合里面能看到了 +7 一怀馨秋 2026-08-26 7/350 2026-08-26 11:23 by zhaosm1982
[基金申请] 国际合作可查了,中了面上 (EPI+1)(金币+50) +18 Ldrop2023 2026-08-26 18/900 2026-08-26 11:15 by cmrandy
[基金申请] 系统进不去 +4 yanglien 2026-08-26 5/250 2026-08-26 11:10 by wenfengw83
[基金申请] 项目信息和经费信息在系统里都可以看到了 +6 wittyboy 2026-08-26 14/700 2026-08-26 10:55 by wittyboy
[基金申请] 牛来!米来!面来! +8 beefly 2026-08-26 8/400 2026-08-26 08:37 by xuzhipiao
信息提示
请填处理意见