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象牙白

银虫 (小有名气)

[求助] 8kb的质粒转化小提质粒后跑胶只有1.5kb条带最亮 已有5人参与

大家好，我是最近两个月开始做定点突变，目的质粒是8kb，经过几次做单点突变实验在amp平板上一共收集到32个单克隆都送去测序，全都没有信号。于是将测序的样品跑胶发现全是在1.5kb处有最亮的条带。后来慢慢排查这个1.5kb条带怎么产生的，同时将所有枪头等用到的器材全都灭菌一次，并且把转化前的原始质粒也跑一次胶，发现原始质粒里有1.5kb的条带，见图。目前的状况是，我单单对质粒进行转化（没有做点突变）然后小提质粒后跑胶最亮还是1.5kb，拿去测序完全不对。被蒙圈了，求大侠援助.

8kb的质粒转化小提质粒后跑胶只有1.5kb条带最亮
xmc.png
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小元，加油！
1楼 2016-08-08 23:07:41
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-08-09 08:06:20
（然后小提质粒后跑胶最亮还是1.5kb，拿去测序完全不对。）这什么质粒，测序结果发来看看。这种多次突变的话楼主应该选PUC的拷贝型质粒呀，构建完后在转目的质粒。实验要一步一步来的，贪多嚼不烂。
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采菊东篱下，悠然见南山。
3楼2016-08-09 08:02:53
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闲来小译

金虫 (正式写手)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-08-09 08:06:30
原始质粒挺脏的，怎么得到的？如果是1.5kb，质粒也太小了，还会有抗性基因的表达？确定你用的抗生素是有效的。如果已知8kb上特定序列信息，可以用菌落PCR筛选正确的8kb质粒。
PS：胶图上的三号孔是什么鬼？
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4楼2016-08-09 08:04:52
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vanchy

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
质粒多的话建议把质粒纯化一下再转化
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12楼2016-08-10 16:45:57
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普通回帖

象牙白

银虫 (小有名气)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖提问 2016-08-09 08:06:08
我上周末做了原始质粒的切胶纯化，在转化，发现结果还是一样的，1.5kb处仍然是很强的条带。
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小元，加油！
2楼2016-08-08 23:10:50
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象牙白

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 闲来小译 at 2016-08-09 08:04:52
原始质粒挺脏的，怎么得到的？如果是1.5kb，质粒也太小了，还会有抗性基因的表达？确定你用的抗生素是有效的。如果已知8kb上特定序列信息，可以用菌落PCR筛选正确的8kb质粒。
PS：胶图上的三号孔是什么鬼？

三号孔是转化完后在同一个板子挑的单个菌株，它好像转化的是对应的质粒的4kb的条带，现在我就是扩增我的质粒都遇到困难，完全扩增不出来。
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小元，加油！
5楼2016-08-09 12:17:17
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象牙白

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 781055707 at 2016-08-09 08:02:53
（然后小提质粒后跑胶最亮还是1.5kb，拿去测序完全不对。）这什么质粒，测序结果发来看看。这种多次突变的话楼主应该选PUC的拷贝型质粒呀，构建完后在转目的质粒。实验要一步一步来的，贪多嚼不烂。

我只做了单点突变，选了5个点，突变不出来后，我就不做点突变，直接把原来的质粒转化扩增，在这种情况下转化小提质粒我都得不到原来质粒相同的测序结果。不知道为什么
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小元，加油！
6楼2016-08-09 12:19:12
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象牙白

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 闲来小译 at 2016-08-09 08:04:52
原始质粒挺脏的，怎么得到的？如果是1.5kb，质粒也太小了，还会有抗性基因的表达？确定你用的抗生素是有效的。如果已知8kb上特定序列信息，可以用菌落PCR筛选正确的8kb质粒。
PS：胶图上的三号孔是什么鬼？

原始质粒是找一个老师要的，送去测过序，测序结果是正确的。
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小元，加油！
7楼2016-08-09 12:21:34
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jie123400

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你这是质粒污染？把原始质粒做单酶切，回收条带再连接看是否能得到正确质粒。
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8楼2016-08-09 14:44:23
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象牙白

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by jie123400 at 2016-08-09 14:44:23
你这是质粒污染？把原始质粒做单酶切，回收条带再连接看是否能得到正确质粒。

我把质粒给另外一个同学做转染和提取，看结果会怎么样。
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小元，加油！
9楼2016-08-09 18:42:32
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少文329

新虫 (初入文坛)
质粒的大小本来用线性maker就看不出来，不知道楼主用的什么maker

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10楼2016-08-09 19:14:42
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