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假人人

新虫 (小有名气)

[交流] 两个酶切位点buffer不同 已有16人参与

我在构载体的时候,两个酶切位点的buffer不一样,需要先用一个做酶切,然后跑胶回收后再用另一个酶做酶切,然后再跑胶,再回收,可是当我第二次酶切时由于浓度太低,跑胶是几乎都没带,请问各路大神该怎么办?

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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)

★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
xn8008: 金币+1, 应助指数+1, 欢迎发帖交流 2016-07-11 07:05:08
可以找一个最适合的buffer,有网站专门匹配的。

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2楼2016-07-11 00:35:14
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)

你要知道,你每次切胶回收,都是在损耗的产物

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3楼2016-07-11 00:35:57
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781055707

木虫 (著名写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
1,是提高模板浓度。2.用TAKARA的快酶,不用考虑BUFFER
采菊东篱下,悠然见南山。
4楼2016-07-11 09:51:54
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不爱做实验

银虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
1、加大第一次酶切及其回收的量,buffer可以综合考虑两种酶切效率均比较高的那个buffer
2、有时看不清楚条带,但是已知目的条带大小参考mark位置来直接切胶也可以,但不是十分建议这么做。
5楼2016-07-11 09:57:16
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假人人

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 凯伦爱佳佳 at 2016-07-11 00:35:14
可以找一个最适合的buffer,有网站专门匹配的。

我用的是NEB的酶,酶切位点分别是Bgl II和Pml I

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6楼2016-07-11 10:03:02
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假人人

新虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 不爱做实验 at 2016-07-11 09:57:16
1、加大第一次酶切及其回收的量,buffer可以综合考虑两种酶切效率均比较高的那个buffer
2、有时看不清楚条带,但是已知目的条带大小参考mark位置来直接切胶也可以,但不是十分建议这么做。

我用的是NEB的酶,酶切位点分别是Bgl II和Pml I。

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7楼2016-07-11 10:05:38
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010308Jing

木虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
NEB的Cutsmart Buffer或者是Fermantas的Tango Buffer大部分酶都适用的
http://www.thermofisher.com/cn/zh/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/thermo-scientific-restriction-modifying-enzymes/restriction-enzymes-thermo-scientific/conventional-restriction-enzymes-thermo-scientific/reaction-conditions-for-restriction-enzymes.html
8楼2016-07-11 14:34:29
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feierorange

铜虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
如果实在找不到合适的buffer,分步酶切,第一种酶切后,取少量检测,确认切开后,不跑胶,直接回收,在回收产物中加入第二种酶,酶切完成后再最后跑胶。
9楼2016-07-11 14:46:24
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不爱做实验

银虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
7楼: Originally posted by 假人人 at 2016-07-11 10:05:38
我用的是NEB的酶,酶切位点分别是Bgl II和Pml I。
...

你看看两种酶公共的buffer要是效率也够高就可以,不行的话就单酶切,回收后再另一种酶切
10楼2016-07-11 14:56:39
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